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DNA測序原理和方法
點擊次數：1611 發布時間：2016-5-16
DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。美國PE ABI公司已生產出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用zui多的一種型號。本實驗介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規程。
【原理】 ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個堿基的3"末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定dna片段的堿基順序或大小和定量的精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
【試劑與器材】
1．BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。
2．pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L，試劑盒配套試劑。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4．DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2g/L，即200ng/μl。
5．引物 需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6．滅菌去離子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離，PE公司產品。
8．3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11．POP 6測序膠 ABI產品。
12．模板抑制試劑(TSR) ABI產品。