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DNA測(cè)序原理和方法
點(diǎn)擊次數(shù):1609 發(fā)布時(shí)間:2016-5-16
DNA序列測(cè)定分手工測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序,手工測(cè)序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測(cè)序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流。美國(guó)PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測(cè)序儀,其中310型是臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中使用zui多的一種型號(hào)。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABI PRISM 310型DNA測(cè)序儀的測(cè)序原理和操作規(guī)程。
【原理】 ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測(cè)序儀),采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳,應(yīng)用該公司的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法),因此通過(guò)單引物PCR測(cè)序反應(yīng),生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3"末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物,使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳,從而避免了泳道間遷移率差異的影響,大大提高了測(cè)序的度。由于分子大小不同,在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同,當(dāng)其通過(guò)毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí),激光檢測(cè)器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光,以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,并在CCD攝影機(jī)上同步成像,分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列,從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測(cè)定dna片段的堿基順序或大小和定量的精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物,包括DNA測(cè)序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一,避免了配膠條件不一致對(duì)測(cè)序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集,分析和儀器運(yùn)行等軟件。它使用的CCD攝影機(jī)檢測(cè)器,使DNA測(cè)序縮短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析為10~40min。
由于該儀器具有DNA測(cè)序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可進(jìn)行DNA測(cè)序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長(zhǎng)片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外,還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測(cè)、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
【試劑與器材】
1.BigDye測(cè)序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix,內(nèi)含PE四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反應(yīng)緩沖液等。
2.pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對(duì)照模板 0.2g/L,試劑盒配套試劑。
3.M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,試劑盒配套試劑。
4.DNA測(cè)序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA,濃度為0.2g/L,即200ng/μl。
5.引物 需根據(jù)所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
6.滅菌去離子水或三蒸水。
7.0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離,PE公司產(chǎn)品。
8.3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中,冰醋酸調(diào)pH至5.2,定容至100ml,高壓滅菌后分裝。
9.70%乙醇和無(wú)水乙醇。
10.NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無(wú)水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻,室溫可保存1年。
11.POP 6測(cè)序膠 ABI產(chǎn)品。
12.模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。