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DNA測序原理和方法
點擊次數(shù):1616 發(fā)布時間:2016-5-16
DNA序列測定分手工測序和自動測序,手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等dna測序儀,其中310型是臨床檢測實驗室中使用zui多的一種型號。本實驗介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。
【原理】 ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀),采用毛細管電泳技術取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳,應用該公司的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法),因此通過單引物PCR測序反應,生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3"末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物,使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內電泳,從而避免了泳道間遷移率差異的影響,大大提高了測序的度。由于分子大小不同,在毛細管電泳中的遷移率也不同,當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時,激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測,激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光,以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光,并在CCD攝影機上同步成像,分析軟件可自動將不同熒光轉變?yōu)镈NA序列,從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定dna片段的堿基順序或大小和定量的精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物,包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一,避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集,分析和儀器運行等軟件。它使用的CCD攝影機檢測器,使DNA測序縮短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析為10~40min。
由于該儀器具有DNA測序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外,還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
【試劑與器材】
1.BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix,內含PE四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反應緩沖液等。
2.pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2g/L,試劑盒配套試劑。
3.M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,試劑盒配套試劑。
4.DNA測序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1μl為宜。本實驗測定的質粒DNA,濃度為0.2g/L,即200ng/μl。
5.引物 需根據(jù)所要測定的DNA片段設計正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
6.滅菌去離子水或三蒸水。
7.0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離,PE公司產(chǎn)品。
8.3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中,冰醋酸調pH至5.2,定容至100ml,高壓滅菌后分裝。
9.70%乙醇和無水乙醇。
10.NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻,室溫可保存1年。
11.POP 6測序膠 ABI產(chǎn)品。
12.模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品。