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PCR操作范例及反應(yīng)體系的組成
點(diǎn)擊次數(shù)：2839 發(fā)布時(shí)間：2017-8-14
一、PCR操作范例
在一個(gè)典型的pcr反應(yīng)體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個(gè)合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min，引物與模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在循環(huán)前模板預(yù)變性3～5min；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸3～5min以上，確保擴(kuò)增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應(yīng)中各成份的組成，加入量和反應(yīng)條件，使人們以此為基礎(chǔ)，對(duì)不同的研究對(duì)象逐項(xiàng)改變來(lái)找到*反應(yīng)條件，特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應(yīng)條件供參考。
表22-1 PCR反應(yīng)混合液
成分
加入體積（μl）
zui終濃度
雙蒸餾水
53.5
10×反應(yīng)緩沖液[1]
10.0
[1×]Mg2+1.5mmol/l K+50mmol/L
4×dNTPs(各1.25mmol/L)
16.0
各200μmol/L
λ-DNA模板（全長(zhǎng)48.5kD）
10.0
1ng/次
引物1,2（各25bp,20μmol/L）[3,4]
5.0
1.0μmol/L（100pmol）
Taq聚合酶儲(chǔ)存液[2]
0.5
2U/100μl
總體積（pH8.3）
100.0
石蠟油
50～100.0
擴(kuò)增條件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30個(gè)循環(huán)。
注：[1]反應(yīng)緩沖液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),
15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,
0.01%(W/V)明膠（Sigma G2500）
[2]酶儲(chǔ)存緩沖液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,
20mmol/L Tris-HCl ph8.0
0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT
200μg/ml明膠
0.5%吐溫20，0.5% Nonidet P40
[3][4]引物，1，2：擴(kuò)增λ-噬菌體基因中500bp的片段
引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)
引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)
注意（3’）端有2個(gè)bp互補(bǔ)故易生成50bp的雙體
二、PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成
（一）PCR緩沖液（PCr Buffer）
用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見(jiàn)PCR操作范例。于72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)單位，接近于7.2。二價(jià)陽(yáng)離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)表明，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無(wú)任何作用。
1．Mg2+濃度Mg2+的*濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時(shí))，但并非對(duì)任何一種模板與引物的結(jié)合都是*的。使用靶序列和引物結(jié)合時(shí)，都要把Mg2+濃度調(diào)到*，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2+過(guò)量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Mg2+不足易使產(chǎn)量降低。