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傳統mRNA差異顯示技術與第二代差異顯示系統
點擊次數：1203 發布時間：2017-8-7
真核生物中，從個體的生長、發育、衰老、死亡，到組織的分化、凋亡以及細胞對各種生物、理化因子的應答，本質上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30 000個不同的基因，但在生物體內任意細胞中只有10%的基因得以表達，而這些基因的表達是按事件和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達。其包括新出現的基因表達與表達量有差異的基因表達。生物體表現出的各種特性，主要是由于基因的差異表達引起的。由于基因差異表達的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制，通過比較同一類細胞在不同生理條件下或在不同生長發育階段的基因表達差異，可為分析生命活動過程提供重要信息。
研究基因差異表達的主要技術有差別雜交（篩選）（differential hybridization）、扣除（消減）雜交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）、mRNA差異顯示（mRNA differential display， DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization， SSH）、代表性差異分析（represential display analysis， RDA）、交互扣除ＲＮＡ差別顯示技術（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表達系列（serial analysis of gene expression， SAGE）分析和電子消減（electronic subtraction）和DNA微列陣分析（DNA microarray）等。
這里我們重點介紹傳統mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR）和第二代差異顯示系統：限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）
傳統mRNA差異顯示技術（DDRT-PCR）是根據絕大多數真核細胞mRNA3"端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。該方法的創始人Liang P和Pardee A根據Poly A序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3′-錨定引物，其通式為5"-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5′端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行pcr擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數字大體涵蓋了在一定發育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便zui終獲得差異表達的目的基因。
原理見下圖：
傳統mRNA差異顯示技術與第二代差異顯示系統 雖然mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）具有很多優點:1)速度快,較易操作;2)由于pcr擴增技術的應用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;3)可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異。但在實際操作中仍存在一些問題,主要表現在:
1)出現差別條帶太多,假陽性率高達70%左右,重復性差,且對高拷貝數的mRNA具很強的傾向性;
2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個基因是已經研究過的，哪些是未知基因
3)得到的有差異的擴增條帶短,一般在110～450bp之間；
4）以poly(A)為引物的PCR擴增只適合真核生物。
所以差別顯示技術自1992年建立后，一直在不斷進行著改進。第二代差異顯示系統:限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）就是一個很有效的改進。
R傳統mRNA差異顯示技術與第二代差異顯示系統FDD-PCR不是直接擴增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進行擴增。正是RFDD-PCR系統使用了一系列特殊接頭和引物，特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應使RFDD-PCR分析具有高度的重復性，解決了*代差別顯示系統的重復性問題；因為RFDD-PCR技術不使用以poly(A)為引物的PCR擴增，因而該系統對原核和真核系統皆適用；在*代的差異顯示系統中，下游引物特異性結合poly(A)尾，因此與3"端未翻譯區域相對應的差異表達序列大部分被鑒別出，而RFDD-PCR 采用優先切割翻譯序列的限制性內切酶（如TaqI），因此可以優先展示編碼區，更加適合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差異顯示基因后，與disploy Fit網絡相連后，可以確定哪個基因是已經研究過的，哪些是未知基因，對下一步研究有很好的知道意義。總之，RFDD-PCR中高度嚴謹的PCR可以產生結果一致的基因表達圖譜，重點放大和展示編碼區，對原核及真核RNA都有用，大大消除假陽性。原理見右圖