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原位聚合酶鏈式反應與原位反轉錄聚合酶鏈式反應操作規(guī)程
點擊次數(shù)：1440 發(fā)布時間：2017-8-2
原位聚合酶鏈式反應（in situ PCR）和原位反轉錄聚合酶鏈式反應（in situ RT-PCR）操作規(guī)程
（一）、儀器設備
英國Thermo Hybaid原位PCR儀。
（二）、操作流程
1、原位PCR步驟
1）預處理：
（1）切片常規(guī)脫蠟；
（2）0.2mol/L HCl處理10min；
（3）5μg/ml蛋白酶k消化組織37℃10min；
（4）Nase消化組織37℃ 30min；
（5）梯度酒精脫水，室溫干燥。
2）原位擴增：
（1）切片滴加特異性序列引物30μLpcr擴增反應液，覆蓋硅化蓋玻片，石蠟油封邊；
（2）PCR熱循環(huán)：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30個循環(huán)，72℃延伸10min；
（3）氯洗去蓋玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脫水，干燥。
3) 原位雜交：
（1）加地高辛標記探針的雜交液，98℃變性10min，-20℃退火5min，42℃雜交過夜。
（2）雜交后用2×SSC洗滌10min，3次，1×SSC洗滌10min，3次；
（3）緩沖液洗滌10min，3次；
（4）加堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體復合物，37℃，2h；
（5）緩沖液洗滌5min，3次；
（6）NBT、BCIP暗處顯色，鏡下控制，終止顯色。
（7）常規(guī)脫水：透明、封固。
2、原位RT-PCR步驟
1）預處理：
（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸餾水洗；
（2）95℃加熱3min，滅活殘存的蛋白酶。
2）原位擴增：
（1）在有RNA酶抑制劑存在的條件下，用隨機六聚物進行逆轉錄反應；
（2）用熱啟動法進行PCR擴增。標本加熱至75℃時加上反應液，覆以蓋玻片，四周用指甲油密封。然后將溫度升至95℃，2min。再將熱循環(huán)儀設定為95℃，45s，55℃，1min和75℃，45s，共26次循環(huán)；
（3）擴增結束后，在80℃烤15min～30min。
3）原位雜交：
（1）雜交前標本95℃加熱3min；
（2）加上雜交液，濕盒內50℃過夜；雜交液組成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC，50％甲酰胺，0.33mg/ml變性的鮭魚精子DNA， 每0．5mL雜交液內含生物素標記探針1ng。
（3）擴增的β-肌動蛋白和IL-6用DAKO檢測試劑盒K600(鏈霉卵白素，生物素標記的堿性磷酸酶和硝基四氮唑藍)檢測。陽性反應呈紫色。