動物細胞染色體DNA之制備詳細的方法步驟!
閱讀:2179 發(fā)布時間:2012-10-18
動物細胞染色體DNA之制備
I.目的
動物、植物及微生物等的基因圖譜(gene mapping)的構(gòu)筑,以及基因順序(gene sequencing)的建立與分析比較,是目前分子生物研發(fā)的重要課題。本實驗設計乃針對動物細胞培養(yǎng)之后,抽取染色體DNA為*步,后續(xù)的DNA定序、基因分析、圖譜建立、DNA鑑定等于淵展開。
以目前的估計,人類約有10萬個基因,30億個堿基。預定在2005年將人類基因*解析出來,并確定它們在染色體上的位置。根據(jù)1990年當時的物價,每解析出一個堿基的平均成本約為美金1元,故HGP總共需約30億美金來完成。
一旦人類基因輿圖*解析出來之后,科學家就可以尋找每段基因的功能,利用這些資料進一步找出疾病(如ai癥或心臟病)與基因的關(guān)系,另外亦提供開發(fā)新藥或?qū)ふ倚轮委煼椒ǖ念I(lǐng)域,如同在美國NASDAQ上的網(wǎng)路股一樣,充滿了無限的想像空間。在巨大商業(yè)利益的引誘之下,許多私人制藥公司已經(jīng)開始投入HGP的研究工作,期能將重要的基因找出來
II.染色體DNA的制備
1.儀器用具:
a. 無菌操作臺
b. 37 ℃細胞培養(yǎng)箱
c. 倒立顯微鏡
d. 50 ℃恒溫箱具搖盪器
e. 冷凍離心機
2.藥品及試劑:
a. 同實驗20
b. Digestion buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% SDS, fresh 0.1 mg/ml proteinase K)
c. phenol/chloroform
3.方法步驟:
1)培養(yǎng)HeLa細胞在100 mm培養(yǎng)皿中3~4天,讓細胞佔滿生長平面空間(confluence < 3 ´ 107 cells ),加入10 ml PBS緩衝液清洗細胞表面,再將PBS儘量*吸掉。
2)加入1 ml Trypsin-EDTA(以能覆蓋細胞表面為原則),置入37 °C細胞培養(yǎng)箱數(shù)分鐘,單層細胞全脫落。
3)加入3 ml培養(yǎng)液沖洗下細胞,在4 °C下以4,000 rpm離心1分鐘。
4)吸掉上層液,加入5 ml PBS懸浮細胞,在4 °C下以4,000 rpm離心1分鐘。
5)吸掉上層液,加入30 ml digestion buffer懸浮細胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml微量離心管中,置于搖盪器上放入50 °C恒溫箱中過夜*。
6)取出微量離心管,小心加入300 ml phenol 萃取(參照實驗2)。
7)離心后轉(zhuǎn)移上清液至新的微量離心管,加水成總體積為500 ml,加入phenol/chloroform做萃取(參照實驗2)。
8)離心后,做酒精沈淀DNA(參照實驗2)。
9)將染色體DNA懸浮于300 ml TE溶液中,取少量作DNA定量分析(參照實驗2)。
10)取染色體DNA用EcoRI做限制酶切割,并做DNA電泳分析(參照實驗3)。
*注:1.在步驟5之后,若DNA黏滯性太高,無法做萃取時,建議在過夜反應后,以1ml針筒劇烈抽放染色體DNA,以抽放重覆動作,可把DNA作物理性截斷(shearing),或利用超音波破膜機來截斷DNA。
2.染色體DNA若有截斷處理,到步驟10即可省略限制酶EcoRI的切割,直接作電泳分析。
參考資料:
顯微鏡百科
http://www.jiance17.com