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各類聚合酶鏈式反應(PCR)技術特性及缺點
閱讀：115 發布時間：2024-10-21PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，是體外DNA擴增技術之一，至今已經超過30年的歷史。
PCR基本原理：
PCR可以將目標DNA片段擴增一百萬倍以上，其原理是在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。
標準 PCR 過程分為三步：
1.變性（Denaturation）：利用高溫使DNA 雙鏈分離。DNA雙鏈之間的氫鍵在高溫下（93- 98℃）被打斷。
2.退火（Annealing）：在 DNA 雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA 上。
3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降溫時結合上的引物處開始沿著DNA 鏈合成互補鏈，延伸完成，則完成一輪循環，DNA片段數增加一倍。
往復循環這三個步驟25-35 次，DNA 片段數將得到指數級增加。
PCR的巧妙之處在于針對不同的目標基因可以設計不同的引物，使目標基因片段在短時間內得到百萬級的放大。
目前為止，PCR可以分為三類，分別是普通PCR、熒光定量PCR和數字PCR。
第一代普通PCR
采用普通PCR 擴增儀來對靶基因進行擴增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳對產物進行檢測，只能做定性分析。
第一代PCR主要缺點：
容易發生非特異性擴增和假陽性結果。
檢測耗時長，操作繁瑣。
只能做定性檢測。
第二代熒光定量PCR
熒光定量PCR（Real-Time PCR），也叫做qPCR，通過在反應體系中加入能夠指示反映進程的熒光探針，通過熒光信號的積累來監測擴增產物的積累，通過熒光曲線來判斷結果，并可以借助Cq 值和標準曲線來定量。
qPCR 技術由于操作過程在封閉體系中進行，降低了污染概率，并且可以通過對熒光信號監測從而進行定量檢測，因此臨床應用最為廣泛，已成為PCR中的主導技術。
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為：TaqMan熒光探針、分子信標和熒光染料。
1)TaqMan熒光探針：
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成全同步。
2)SYBR熒光染料：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3)分子信標
是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。
PCR產物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光。
第二代PCR主要缺點：
靈敏度還有欠缺，低拷貝標本檢測不準確。
存在背景值影響，結果易受干擾。
當反應體系中有PCR抑制物時，檢測結果易受干擾。
第三代數字PCR
數字PCR（DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR）通過終點檢測計算目標序列的拷貝數，無需采用內參和標準曲線即可進行精確的絕對定量檢測。
數字PCR采用終點檢測，不依賴于Ct值（循環閾值），所以數字PCR反應受擴增效率的影響降低，對PCR反應抑制物的耐受能力提高，具有很高的準確度和重現性。
由于具備高靈敏度、高精確度的特點，不易被PCR反應抑制劑干擾，無需標準品可實現真正意義的絕對定量，而成為研究和應用熱點。
根據反應單元的不同形式，主要可分為微流體式、芯片式和微滴式三大類系統。
1)微流體數字PCR，Microfluidic digital PCR，mdPCR。
基于微流控技術，對DNA模板進行分液，微流控技術能實現樣品納升級或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再與PCR反應體系結合，mdPCR已逐漸被其他方式取代。
2)微滴數字PCR，Droplet-based digital PCR，ddPCR。
利用油包水微滴生成技術對樣品進行微滴化處理，將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。
第三代PCR主要缺點：
儀器和試劑昂貴。
模板質量要求較高，模板量超過微體系量將導致無法定量，過少則定量準確度降低。
當存在非特異性擴增時也會產生假陽性。
PCR的各種延伸技術
1.遞減PCR（touchdown PCR）：前幾循環溫度逐漸下降。
2.逆轉錄PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆轉錄而來的cDNA 為模板，也因為是從表現型基因來進行增量的，由此產生出來的cDNA 產物不帶有內含子（基因中不具意義的段落），常應用于分子克隆技術。
3.熱啟動PCR（hotstart PCR）：以高熱激活型核酸聚合酶進行反應，減少非專一性產物。
4.巢式PCR（nested PCR）：先用低特異性引物擴增幾個循環以增加模板數量，再用高特異性引物擴增。
5.多重PCR（multiplex PCR）：在同一個管中使用多組引物。
6.復原條件PCR（reconditioning PCR）：PCR 產物稀釋 10 倍后重新放入原濃度的引物和dNTP 等循環 3 次，以消除產物中的異二聚體。
7.dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使用high-fidelity DNA polymersae、T7RNA聚合酶與Phi6 RNA replicase；從雙股 DNA轉錄為對應的雙股RNA（dsRNA）。可應用于RNAi實驗操作。
8.COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature PCR):用以檢測突變或特殊等位基因的PCR 應用技術。