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原代培養(yǎng)操作步驟與注意事項
閱讀：227 發(fā)布時間：2023-11-13 原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后，經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個細(xì)胞或單一型細(xì)胞群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定的營養(yǎng)條件下，生存、生長和繁殖。原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分，生長緩慢，但是更能代表所來源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗效果很好。
操作步驟：
1、剪切組織：先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術(shù)鑷去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清洗后，用手術(shù)刀將組織切成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。
2、消化分離：消化分離的目的是將細(xì)小的組織塊消化分離成細(xì)胞團(tuán)或分散的單個細(xì)胞，以利于進(jìn)一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。
3、培養(yǎng)：細(xì)胞懸液用計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為（2～5）×105 cells／ml，或?qū)嶒炈杳芏龋盅b于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，5％CO2，37℃靜置培養(yǎng)。一般3～5d，原代培養(yǎng)細(xì)胞可以黏附于瓶壁，并伸展開始生長，可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1／2的新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d后換液，一般7～14d可以長滿瓶壁，進(jìn)行傳代。
注意事項：
（1）無菌操作：細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗的常見原因，必須加強(qiáng)各個環(huán)節(jié)的無菌操作觀念，以預(yù)防為主，一旦污染，一般很難消除。
（2）培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細(xì)胞生存和生長的必要條件。由于細(xì)胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養(yǎng)液的要求有一定的差異，必要時可用預(yù)實驗的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液。
（3）胎牛血清：胎牛血清對于維持培養(yǎng)細(xì)胞的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵性作用。可選擇多種不同批號的胎牛血清進(jìn)行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號胎牛血清后，就保持應(yīng)用至實驗完成。想了解血清的秘密，可以參考Nothing：關(guān)于血清，你不知道的太多了
（4）膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時間過長(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導(dǎo)致消化時間過長，細(xì)胞損傷增加。
（5）L-谷氨酰胺：幾乎所有細(xì)胞對谷氨酰胺都有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時，細(xì)胞會因生長不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺。
（6）靜置培養(yǎng)：原代細(xì)胞在消化分離后，置于CO2培養(yǎng)箱的頭24～48h (必要時72h)內(nèi)，應(yīng)處于絕對靜置狀態(tài)，切忌不時地取出培養(yǎng)瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖，初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必?fù)?dān)心培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分會消耗光，在細(xì)胞增殖之前對營養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展。
（7）消化時間：一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經(jīng)松散，略經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞，過久的消化往往導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低。
（8）其他生長因子：經(jīng)過以上處理，一般原代分離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功。對于少數(shù)特殊類型細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長因子，如胰島素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外，內(nèi)毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。