酶聯斑點（Elispot）實驗服務
酶聯斑點(Elispot) 技術概述：
酶聯斑點(Elispot) 全名為酶聯免疫斑點檢測，英文: Enzyme-linked Immunospot Assay.它結合了細胞培養技術與酶聯免疫吸附技術(即ELISA技術)， 能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況。其技術原理，一句話概括就是:用抗體捕獲培養中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯斑點顯色的方式將其表現出來。
1、實驗的準備工作
(1)設備與耗材:
①超凈工作臺;
②5% CO2 37°C細胞培養箱;
③P20，P200， P1000 微量移液器,
④P300 8通道微量移液器，P300 12通道微量移液器,
⑤Biosys ELISPOT Reader
⑥P20，P200， P1000 槍頭;
⑦多道移液器吸槽;
⑧0.5mL, 1.5mL EP管。
(2)溶液配制
①PBS:用分析純試劑，Millipore級別的純水配制， 高壓滅菌。
②PBST: PBS加入0.05% Tween-20,注意無菌操作。儲存于20-25°C, 可存放一個月。
③70%乙醇:分析純乙醇70mL，加入Millipore級別的純水至100mL。
④30%乙醇:分析純2醇30mL,加入Millipore級別的純水至100mL.
⑤包被抗體(coating antibody, Primary antibody): 照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時，用PBS稀釋50倍，每孔50uL。
⑥封閉液:用PBS將試劑盒中的封閉存儲液(Blocking stock solution R)稀釋10倍，每孔200uL。
⑦抗體稀釋液:注意，只是用來稀釋檢測抗體和酶聯親和素。用PBS將試劑盒中的稀釋存儲液(Dilutionbuffer R)稀釋10倍
⑧檢測抗體(Biotinylated detector antibody, Secondary antibody):照U-Cytech說明書， 加入雙蒸水溶解。使用時，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100uL。
⑨酶聯親和素(Streptavidin-HRP conjugate):照U-Cytech說明書，加入雙蒸水溶解。使用時，用抗體稀釋液稀釋100倍，每孔100uL。
D AEC顯色液: 照U-Cytech說明書， 用100mL 30%乙醇溶解底物緩沖液膠囊(Substrate bufercapsule),然后加入3.3mL AEC儲存液(AEC stock solution),混合均勻后10ml每支分裝，-200C保存。
使用時，解凍，每孔加入100pL.
①PHA刺激物:將儲存液(2mg/ml，Murex)分裝成20μL/EP管， -20*C長期凍存。 使用時，加入980μLU-Cytech無血清培養基(或者1640基本培養基),成為工作液(40μg/mL，10倍終濃度)，每孔加入10μL, 終濃度4μg/mL。
②U-Cytech無血清培養基:我們推薦無血清ELISPOT技術，它能排除血清的干擾，結果更加穩定可靠,背景也更好。如果沒有，可以用含10%血清的1640培養基代替。
2、ELISPOT標準操作程序
(1)第—天: ELISPOT包被程序設計好試驗，把每個孔要加入的內容做成卡片，到時候就會從容很多。每孔加入15μL 70%的醇預濕30秒。
注意:
①未潤濕的PVDF膜是潔白的、不透明的，經過乙醇潤濕之后，顏色變暗，變成半透明狀，很容易觀察二者的區別。
②加乙醇的時候，槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不到刺到PVDF膜。
③有時候，加入的乙醇掛在孔壁上， 這時要蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一 旦接觸到PVDF膜，就會在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發生變化。
④15μL 是經過優化的體積，它能保證剛好*浸潤整塊膜，而不會有剩余。如果加大使用量，乙醇溶液就會透過膜而積存在膜的背面,加深實驗的背景。
⑤加入100μL去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留。
⑥按照試劑盒的使用說明，將包被抗體儲存液稀釋在PBS緩沖液中，每孔加入50μL，4°C包被過夜。
⑦(次日)傾倒包被液，用PBS洗滌5次，后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。
⑧加入200μL試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時。
⑨傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進行細胞培養。(也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌- -次, 拍干,封口，4°C保存，可以在4°C保存數周。)
(2)第二天:鋪細胞，加入刺激物，培養
①整個實驗設置-組正對照(PHA刺激), 每一個細胞樣品(同-個捐獻者或者實驗動物)要設一個負對照
(不加刺激物)，整塊板還要加一個背景負對照(不含細胞，只加培養基和所有的檢測試劑)。
②填好實驗卡片，用以指導實驗的安排和細胞及試劑的添加。每一個細胞/刺激物的組合設置2-4個孔的重復(想要有統計學的意義，每個細胞/刺激物設4個孔的重復)。
④取出封閉好的板，準備加入細胞。如果是以前做的封閉，可以加入200μL 的U-Cytech無血清培養基,室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復- -次。
⑤按照實驗卡片的安排，加入不同濃度的細胞，100uLwell, 細胞在孔中的分布要盡量均勻(要訣是加入
細胞之后，不要再震動或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓細胞更分散，實際情況剛好相反)。正對照的細胞濃度為1x105/well,實驗組的樣品細胞濃度請自行調整。
⑥加入100μL的U-Cytech無血清培養基到背景負對照孔。
⑦正對照孔加入10μL PHA,終濃度4ug/mL,該濃度能有效刺激IFN-V的分泌。
⑧加入實驗者自己的刺激物(配制成10X終濃度，10uLwell)到實驗孔。 加完刺激物之后不要再拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會讓刺激物在孔中混合均勻，實際上，通過擴散，刺激物也會很快混合均勻。拍擊板子會讓細胞成圈的分布在孔的外周。
⑨當加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養箱，37°C培養18-24小時。 注意在整個培養過
程中避免移動、碰撞培養板。為了取得更好的結果，甚至開關培養箱的箱[ ]也應該禁止。因為碰撞會造成細胞的移位，造成斑點的模糊、拖尾。
(3)第三天:培養后操作
①傾倒孔內的細胞及培養基。
②低滲法將細胞裂解，每孔加入200μL冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘。
③每孔用200μLPBST洗滌10遍，洗滌后- 遍之后,將板倒扣在吸水紙上拍干。
④按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋檢測抗體，每孔加入100μL生物素標記的檢測抗體,37°C 1小時。
⑤每孔用200μL PBST洗滌5遍，洗滌后一遍時， 將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
注意:
①洗滌膜的背面，我們摸索出的辦法是，在-個淺托盤中盛上干凈的PBST,將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。注意，-定要將膜的背面和塑料保護層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜。
②按照試劑盒說明的濃度，用抗體稀釋液稀釋酶標的鏈霉親和素，每孔加入100L, 37°C 1小時。
③每孔用200μL PBST洗滌5遍， 洗滌后-遍時，將PVDF膜板的背面的塑料保護層取下，同時洗滌膜的正反兩面，蓋上保護層，將板倒扣在吸水紙上拍干。
④照試劑盒的說明，解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。
⑤待斑點生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。將板倒扣在吸水紙上,拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內，防止膜發脆、破裂。
⑥將ELISPPOT板置于Biosys Bioreader4000 PRO自動讀板儀內,調節好合適的參數，半點計數,并記錄斑點的各種參數，作統計分析。
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