雙氰胺極性較強(qiáng)，易溶于水，中性及酸性條件下易電離，適合使用默克密理博的兩性離子型親水作用（ZIC®-HILIC）色譜柱分離。FDA 在Bulletin 4487中采用ZIC®-HILIC色譜柱，建立了測(cè)定乳品、蛋白質(zhì)等基質(zhì)的樣品中包括雙氰胺在內(nèi)的LC-MS/MS測(cè)試方法，現(xiàn)把該方法樣品處理及檢測(cè)條件簡(jiǎn)要列出。
 
同時(shí)默克密理博致力于分析方法的開發(fā)，為客戶提供簡(jiǎn)便、快速的解決方案，我們采用ZIC®-HILIC 色譜柱在HPLC-UV條件進(jìn)行了摸索，為客戶提供快速簡(jiǎn)便的測(cè)試方法。
 
默克密理博雙氰胺檢測(cè)柱

應(yīng)用	規(guī)格描述	貨號(hào)
HPLC	ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm	1.50458.0001
LC-MS/MS	ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm	1.50454.0001

 
LC-MS/MS檢測(cè)嬰幼兒奶粉中雙氰胺（FDA Bulletin 4487）
 
FDA #4487方法^[1]中建立了同時(shí)檢測(cè)奶粉及高蛋白產(chǎn)品中可能存在添加的六種含氮物質(zhì)（環(huán)丙氨嗪、雙氰胺、尿素、縮二脲、三縮脲、脲基甲脒）分析方法。方法中采用2%的甲酸水溶液提取，再加入乙腈進(jìn)行蛋白沉淀。提取物使用默克密理博的ZIC®-HILIC色譜柱在液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）儀器上分析，在脫脂奶粉、奶粉、大豆蛋白、面粉、麥麩和谷物基質(zhì)中進(jìn)行標(biāo)樣添加測(cè)試并進(jìn)行了方法驗(yàn)證，該方法測(cè)試雙氰胺 Dicyandiamide （DCD）的平均回收率為 98.1% ，RSD=5.6%，在脫脂奶粉中測(cè)試的檢測(cè)限（LOD）為20ppb，定量限為60ppb.
 
 

LC-MS樣品處理方法^[1-2]

1.稱取一定量的奶粉，加10倍溫水溶解，得奶粉母液樣品。稱取奶粉母液樣品（2.0±0.02g）于50ml PP管中，方法空白樣品量取2.0ml水；
2.方法摸索的樣品可在PP管中加入相當(dāng)于1ppm的雙氰胺對(duì)照品；.校準(zhǔn)曲線用的樣品可在樣品管中分別添加相當(dāng)于0.8-8.0ppm的雙氰胺對(duì)照品；
3.每根PP管中加入18mL 2%的甲酸水溶液，振搖60秒，使所有固型物分散開。為了方便快速移取溶液，可設(shè)置5.0mL的移液器量程到4.5mL，連續(xù)移取4次即得18mL。加入提取液的PP管超聲30分鐘，再振搖1分鐘，放入離心機(jī)中離心20分鐘（4500rpm）。
4.移取離心后的上清液50ul，于1.5ml離心管中，加入950ul乙腈。在加入乙腈后，會(huì)有白色沉淀，可適當(dāng)振搖30秒，再放入離心機(jī)中離心10分鐘。離心后，吸取上清液，用0.20um PTFE膜過(guò)濾至2ml自動(dòng)進(jìn)樣瓶中。必要時(shí)可取濾液100ul，加入500ul的乙腈-2%甲酸水溶液（95/5）稀釋后再進(jìn)行測(cè)試。
 
 

測(cè)試條件

色譜條件
色譜柱：ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm（貨號(hào):1.50454.0001）
流動(dòng)相：A: 95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸銨）
B: 50:50乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸銨）
流動(dòng)相比例：0-5min，100%A.
注:由于雙氰胺保留時(shí)間在3.4min左右，可在5分鐘內(nèi)完成分析。無(wú)需運(yùn)行文獻(xiàn)[2]的梯度程序。必要時(shí)，采用100%的B相機(jī)進(jìn)行色譜柱的沖洗。
進(jìn)樣量：2-5ul（FDA方法中采用20ul）
質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）；去簇電壓:36V；雙氰胺的分子離子[M+1]+ m/z:85.0,子離子m/z:68.0,43.1.
 

FDA方法測(cè)試結(jié)果

雙氰胺的保留時(shí)間tR=3.4min. 檢測(cè)限LOD=20ppm，定量限LOQ=60ppb,加標(biāo)回收率在93-101%，低、高兩個(gè)濃度下的RSD值分別為5.9%和5.3%.

我們采用LC-MS的色譜柱（ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm）在Agilent1260 HPLC上進(jìn)行測(cè)試，218nm下的色譜圖如下：


雙氰胺保留時(shí)間3.1.3min，其中藍(lán)色-奶粉樣品；綠色-奶粉加標(biāo)；紅色-雙氰胺對(duì)照品（1.25ug/ml）。流動(dòng)相：95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM乙酸銨），進(jìn)樣量均為2ul.
 

HPLC方法檢測(cè)嬰幼兒奶粉中雙氰胺

為了方便HPLC的用戶，我們采用ZIC®-HILIC HPLC色譜柱開發(fā)了相應(yīng)的檢測(cè)方法。

樣品前處理
取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中，加18mL 2%的甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，放入離心機(jī)中離心（4000轉(zhuǎn)），20分鐘。取出，吸取上清液50ul，于10ml PP管中，加入950ul乙腈，加蓋密閉，振搖60秒，吸取溶液，過(guò)濾，即得供試液。
或取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉。搖振60秒，再超聲30分鐘，取出，再搖振60秒，靜置，吸取上層溶液，過(guò)濾，即得供試液。（快速處理方法）
加標(biāo)樣品同法配制。樣品配置方法亦可采用LC-MS/MS的處理方法。

色譜條件
流動(dòng)相 （v/v）: A-醋酸銨溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88（必要時(shí)在方法中設(shè)置沖柱程序）
流速:1 mL/min
進(jìn)樣量：20ul

測(cè)試結(jié)果

 

圖中藍(lán)色為標(biāo)樣（1.25ug/ml）,綠色為奶粉空白，紅色為奶粉加標(biāo)（加入量10ug/g）.

采用ZIC®-HILIC色譜柱，HPLC-UV下測(cè)試，無(wú)干擾，可用于雙氰胺的快速檢測(cè)。該方法處理方法簡(jiǎn)單，色譜峰型良好，方法重現(xiàn)性良好（RSD<3%）,檢測(cè)濃度在0.5-10ug/ml之間現(xiàn)行關(guān)系良好（R=0.999）,加樣回收率在95.6-101.5%之間。按照方法1的處理，LOD為1.3ug/g奶粉，按照方法2處理,LOD可達(dá)0.07ug/g。

詳細(xì)方法可參考：

[1] FDA Laboratory Information Bulletin 4487（雙氰胺檢測(cè)方法）
[2]Journal of Chromatography A 1220 （2012） 101–107
[3]FDA Laboratory Information Bulletin 4421（三聚氰胺檢測(cè)方法）

其他相關(guān)詳細(xì)方法，請(qǐng)默克密理博。

直接下載FDA檢測(cè)雙氰胺方法文獻(xiàn)英文原文>>