增加PCR的特異性
1. primers design
   這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件
a  足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量
b  GC% 40%~~~~60%
c  5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性
d  避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC
   e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
   f. 避免3'端的錯配
   g. 避免內部形成二級結構
   h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結構是要加上它們
   i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)
   j. 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
* 引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
   設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
   根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度*行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
   定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核苷的水解。 引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
   Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用 并能影響Polymerase的活性一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調整同樣要記住的是在調整了dNTPs的濃度后要相應的調整Mg離子的濃度對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液
b. 其他的離子
   NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴謹性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經混合了(NH4)2SO4的.當然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發生變性, 當然也就無從談起PCR了.
c. polymerase
   不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真沒的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性
    d. template
    50ul PCR SYSTEM  
human gDNA 0.1ug-1ug
    E.Coli 10ng-100ng
    LamadaDNA 0.5ng-5ng
    Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. termperature
a. denaturation
   常規是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation
b. annealing
   重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據情況配合以Mg離子濃度進行調整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
   原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度
94 5min