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qubit4熒光計(jì)蛋白濃度測定原理

時(shí)間:2023/5/10閱讀:1339
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qubit可以用于蛋白濃度測定
常用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。
以下引用:

6種方法測定蛋白質(zhì)含量
一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法
樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨(消化),氨又與硫酸作用,變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至酸液中,根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例,其反應(yīng)式如下:
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)  
反應(yīng)(1)、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成,反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。
為了加速消化,可以加入cuso4作催化劑,k2so4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液,滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。
計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量,如欲求得 樣品中蛋白含量,應(yīng)將總氮量減去非蛋白
氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量,即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、雙縮脲法(biuret法)
(一)實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲(nh3conhconh3)是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱,放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與cuso4形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵,或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。
紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有:硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。
此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速 ,不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。
(二)試劑與器材
1. 試劑:
(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白(bsa)或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白,配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要,標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,計(jì)算出其純度,再根據(jù)其純度,稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制,酪蛋白用0.05n naoh配制。
(2)雙縮脲試劑:稱以1.50克硫酸銅(cuso4•5h2o)和6.0克酒石酸鉀鈉(knac4h4o6•4h2o),用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液,用水稀釋到1升,貯存于塑料瓶中(或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn),則需要重新配制。
2. 器材:
可見光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。
(三)操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:取12支試管分兩組,分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用水補(bǔ)足到1毫升,然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后,在室溫(20~25℃)下放置30分鐘,于540nm處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值,以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo),光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品的測定:取2~3個(gè)試管,用上述同樣的方法,測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

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