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qubit4熒光計蛋白濃度測定原理

時間:2023/5/10閱讀:1330
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qubit可以用于蛋白濃度測定
常用紫外分光光度法測定蛋白質含量。
以下引用:

6種方法測定蛋白質含量
一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法
樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨(消化),氨又與硫酸作用,變成硫酸氨。經強堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至酸液中,根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例,其反應式如下:
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)  
反應(1)、(2)在凱氏瓶內完成,反應(3)在凱氏蒸餾裝置中進行。
為了加速消化,可以加入cuso4作催化劑,k2so4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液,滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。
計算所得結果為樣品總氮量,如欲求得 樣品中蛋白含量,應將總氮量減去非蛋白
氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量,即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。
二、雙縮脲法(biuret法)
(一)實驗原理
雙縮脲(nh3conhconh3)是兩個分子脲經180℃左右加熱,放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中,雙縮脲與cuso4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。
紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。
此法的優點是較快速 ,不同的蛋白質產生顏色的深淺相近,以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速,但并不需要十分精確的蛋白質測定。
(二)試劑與器材
1. 試劑:
(1)標準蛋白質溶液:用標準的結晶牛血清清蛋白(bsa)或標準酪蛋白,配制成10mg/ml的標準蛋白溶液,可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要,標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量,計算出其純度,再根據其純度,稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制,酪蛋白用0.05n naoh配制。
(2)雙縮脲試劑:稱以1.50克硫酸銅(cuso4•5h2o)和6.0克酒石酸鉀鈉(knac4h4o6•4h2o),用500毫升水溶解,在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液,用水稀釋到1升,貯存于塑料瓶中(或內壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現,則需要重新配制。
2. 器材:
可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。
(三)操作方法
1. 標準曲線的測定:取12支試管分兩組,分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的標準蛋白質溶液,用水補足到1毫升,然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后,在室溫(20~25℃)下放置30分鐘,于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值,以蛋白質的含量為橫座標,光吸收值為縱座標繪制標準曲線。
2、樣品的測定:取2~3個試管,用上述同樣的方法,測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

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