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 原因

解決方法

一抗與膜的孵育時(shí)間不夠

磷酸化蛋白抗體是針對(duì)于特定的一個(gè)或兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)的，特異性很高但往往比常規(guī)的抗體能得到的信號(hào)要弱一些。用合適的緩沖液稀釋，并在4°C與膜孵育過一夜，對(duì)于磷酸化抗體來說很關(guān)鍵。

電泳后的蛋白沒有全部轉(zhuǎn)移到膜上

增加轉(zhuǎn)膜所用的時(shí)間或電壓。通過預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)品判斷轉(zhuǎn)膜是否*，不建議用染料染膜來觀察，因?yàn)檫@樣會(huì)抑制化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

膜的封閉時(shí)間過長

在牛奶中封閉時(shí)間太長會(huì)遮蔽抗原表位并會(huì)把轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白置換下來。封閉只需1小時(shí)（決不要過一夜封閉）。

目的基因的表達(dá)量太少，低于檢測(cè)底限。

每條泳道中上樣總蛋白20 μg通常就足夠了。如果目的基因的表達(dá)水平較低，則可以增加上樣量。或是在做SDS-PAGE之前先做免疫沉淀。嘗試其他細(xì)胞系或是高表達(dá)該蛋白的組織樣品。

二抗太弱。

換用其他批次的二抗或是提高二抗的濃度。

LumiGLO^?試劑沒有按規(guī)定配制或是儲(chǔ)存液試劑A和B已經(jīng)相互污染。

重新配制LumiGLO^?試劑。用抗生物素-HRP和生物素標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)品作為化學(xué)發(fā)光檢測(cè)反應(yīng)的陽性對(duì)照。