化工儀器網
技術文章
恒遠生物|細胞融合的方法與注意事項
閱讀：761 發布時間：2023-12-22一、細胞融合的方法有三種
1.生物方法
2.化學方法
3.物理方法。
二、細胞融合也稱細胞雜交,是指細胞通過介導和培養,在離體條件下用人工方法將不同種的細胞通過無性方式融合(合并)成一個核或多核的雜合細胞的過程。體細胞融合后可形成四倍體或多倍體細胞，由此形成的雜交細胞，其特性會有很大的變化。
三、化學誘導融合
1.鹽類融合法。
此法是應用最早的誘導原生質體融合的方法，鹽類融合劑對原生質體的破壞小，研究應提高其融合率,使其對液泡化發達的原生質體能夠誘發融合。
2.高鈣和高pH值融合法。高Ca2+和高pH值可以誘發融合，提高該方法的使用范圍是亟ji待解決的問題。
3、聚乙二醇融合法(PEG法)。1974年發現的聚乙二醇(PEG)使不同科屬的植物原生質體之間都可以融合，融合率可達30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結合，導致細胞脫水而發生質膜結構的變化，從而引起細胞融合。為了發揮PEG促進細胞融合的效力，必須采用較高的濃度(40%～50%，分子量為6000)，但PEG在高濃度下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。影響原生質體融合的因素很多。特別是環境中的陽離子存在，融合時的pH也對原生質體融合有較明顯的影響。一般來講鈣、鎂離子有助于融合。如有鈣離子存在時，可得到較高的融合率。但在缺乏鈣離子時，若pH較低，融合頻率也較高。這是因為鈣離子和帶負電荷的PEG與細胞膜表面分子相互作用，使原生質體帶電，彼此易于附著發生凝集所致。PEG誘導細胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩定、使用方便等特點，在細胞融合領域取得了可喜的成績，大量的研究仍采用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報道，但存在著對細胞損傷大、殘存有毒性、融合率較底及經驗性大等缺陷。
四、物理誘導融合
1.細胞電融合技術細胞電融合是以脂質膜和脂質一蛋白質膜的電學性質為基礎的，以雙向電泳和電子擊穿細胞質膜的聯合作用為手段，和細胞電注射構成一對互補技術。在短時間強電場的作用下，細胞膜發生可逆性電擊穿，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然后在數分鐘后恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導他們的膜相互融合，從而導致細胞融合。
細胞融合分為兩步：第一步是建立細胞間接觸；第二步，接受區膜結構受擾動而紊亂，然后恢復并融合。根據其誘導細胞接觸的性質，分為特異性和非特異性兩大類。非特異性細胞電融合法是指在進行細胞電融合時，無法排除親本細胞的自體融合而只進行雙親本間的細胞雜交融合。主要原因是細胞間的相互接觸是無選擇性的，是非特異性細胞聚集。非特異性電融合技術包括細胞物理聚集電融合法和細胞化學聚集電融合法。
細胞融合所必需的兩個步驟為：
①細胞間接觸
②接觸區的膜結構受到瞬間擾動而導致融合，只要其中的任意一步有特異性，就能形成特異性的細胞融合。
2.激光誘導法。激光誘導細胞融合術是利用激光微束對相鄰細胞接觸區的細胞膜進行破壞(或擾動)，可將兩個不同特性、不同大小的細胞在顯微鏡下實現融合。即利用光鑷捕捉并拖動一個細胞使之靠近另一個細胞并緊密接觸，然后對接觸處進行脈沖激光束處理，使質膜發生光擊穿，產生微米級的微孔。這樣，由于質膜上微孔的可逆性，細胞開始變形融合，最終成為一個細胞。
使用此技術時，使細胞接觸的方法可用①光俘虜法；②用低濃度的融合劑PEG(5%)使細胞聚法。目前，最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細胞間接觸，即光鑷利用激光高斯光束光場的梯度力把細胞從光束邊緣拉向光束中間，在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時，指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力，該梯度力把細胞豎直地拉到激光束腰下方處，從而實現對細胞的操作。
細胞融合實驗的注意事項
1. 整個制備過程需嚴格無菌及溫度控制。
2. 細胞傳代培養時注意適時更換培養液。
3. SP2/0細胞與脾細胞比例需嚴格控制，這決定了融合率。
4. 融合細胞因細胞膜受損而特別脆弱，操作過程需溫和小心。
5. 融合劑PEG的加入時間需準確把握，避免融合失敗。