酶聯免疫法磺胺多殘留試劑盒使用說明;本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、尿液、雞蛋等樣本中的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs），試劑盒由預包被偶聯抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。

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酶聯免疫法磺胺多殘留試劑盒使用說明

廣州健侖生物科技有限公司

 

酶聯免疫法磺胺多殘留試劑盒使用說明(檢測樣本步驟）

組織樣本（低檢測限）處理方法

1）稱2.0±0.05g 均質組織樣本于離心管中；加入8ml 0.02M PB緩沖液，震蕩2min，4000r/min以上離心10min；

2）取50µl液體用于分析。

 樣本稀釋倍數: 5  檢測下限：2.5ppb  

血清樣本處理方法

1）將血樣本于室溫放置30min，于4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；

2）取1ml血清，加入3ml 0.02 M PB緩沖液混合，混合30s；

3）取50µl用于分析。  

 樣本稀釋倍數：4  檢測下限：2ppb　　

 蜂蜜樣本處理方法

1）稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環境中30min；

2）加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心10min；

3）取2ml上層液體于50-60℃下氮氣吹干，加0.5ml 已稀釋好的復溶液復溶，混合30s；

4）取50µl用于分析。  

樣本稀釋倍數：1  檢測下限：0.5ppb

尿樣本處理方法

1）用3ml 0.02 M PB緩沖液與1ml經離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；

2）取50µl液體用于分析。  

樣本稀釋倍數: 4  檢測下限：2ppb 

5.3.6牛奶樣本處理方法

1）將牛奶樣本用0.02 M PB緩沖液20倍稀釋（如20µl牛奶+380µl 0.02  M PB緩沖液），混合30s；

2）取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數：20  檢測下限：10ppb   

水樣處理方法

1）取水樣200ul加入200ul 2X復溶液，混合30s；

2）取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數：2  檢測下限：1ppb   

雞蛋樣本處理方法

1）用均質器均質雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；

2）稱取2.0±0.05g均質后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min以上離心5min；

3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮氣或空氣吹干；

4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復溶工作液，用渦旋儀渦動1min，室溫4000r/min以上離心5min；

5）去上層有機相，取下層水相50ul用于分析。

樣本稀釋倍數: 4  檢測下限：2ppb

酶聯免疫試驗步驟

 將所需試劑從4℃冷藏環境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。

結果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值

7.2 標準曲線的繪制與計算

以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實際濃度。 若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的*性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。