對不同樣品組進行準確的蛋白質定量是理解生物學的關鍵，但首先需要在樣品中鑒定到該蛋白質。因此，對生物樣品中蛋白質的鑒定仍然是一個重要的工作流程。
本研究應用傳統 DDA 工作流程（Zeno DDA）與 Zeno SWATH DIA 工作流程進行蛋白質、肽段鑒定。后者使用人類序列理論數據庫進行蛋白質鑒定。在 45 分鐘和 10 分鐘微升液相梯度下，比較兩種工作流程在蛋白質和肽段的鑒定水平。
● 樣品準備：人 K562 細胞裂解物的酶解產物，來自SWATH Acquisition performance kit (SCIEX)。進樣量范圍為 12.5 ng - 400 ng。
● 液相方法： ACQUITY UPLC M-Class液相系統（Waters），分析色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18 (2.6 μm, 100 Å, 150 x 0.3 mm)，Trap柱：Phenomenex micro trap (5 μm, 100 Å, 10 x 0.3 mm)，流速：5 μL/min，液相梯度：10 min, 45 min。
● 質譜方法：ZenoTOF 7600系統2臺，兩種采集流程：Zeno DDA、可變窗口Zeno SWATH DIA，樣品平行采集三次。
● 數據處理： Zeno DDA數據用OneOmics™軟件包中ProteinPilot™應用程序，使用人類理論數據庫進行搜庫。Zeno SWATH DIA數據使用DIA-NN[1]軟件處理。
分為計算機模擬譜庫（Library-free）和有譜圖庫兩種分析，其中譜圖庫使用兩種數據庫：Pan Human Library[2]和ProteinPilot™軟件搜索的人類理論數據庫構建樣本譜圖庫。
主要結果
1. Zeno DDA與Zeno SWATH DIA
在蛋白質鑒定的比較
在12.5ng - 400 ng進樣量范圍內，在相同進樣量條件下，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質數量約為Zeno DDA的 2 倍， 2 臺 ZenoTOF™ 7600 系統測試結果一致。進一步進行蛋白質種類比較，Zeno SWATH DIA鑒定的蛋白質幾乎覆蓋了Zeno DDA 鑒定到的蛋白質。
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圖1. 45min液相梯度下，Zeno SWATH DIA
和Zeno DDA蛋白質和肽段鑒定比較結果
注：左圖為蛋白質鑒定結果，右圖為肽段鑒定結果
圖2. Zeno SWATH DIA和Zeno DDA 鑒定
蛋白質的重疊情況
2. Zeno SWATH DIA數據使用Library-free
處理策略和樣本譜圖庫處理策略的比較
相比于通過MS1數據進行定量的Zeno DDA策略來說，Zeno SWATH DIA策略可產生豐富的MS/MS數據，因此可獲得更可靠、更明確的定量數據。使用 Zeno SWATH DIA 工作流程時，無論使用譜圖庫還是Library-free的數據處理策略，定量CV < 20%的蛋白質均占總鑒定蛋白質約90% 。三種不同數據處理方法的鑒定蛋白質數量相似，該結果顯示了Library-free處理方法的能力。
圖3. Library-free策略和 2 個實驗數據庫策略
獲得的鑒定蛋白質結果的比較
隨后比較Library-free處理生成的結果與使用譜圖庫處理的結果，維恩圖（圖 4）顯示二者得到的蛋白質鑒定信息非常相似，進一步增加了Library-free方法的可信度。
圖4. Zeno SWATH IDA數據使用Library-free方法
和有數據庫方法鑒定蛋白質的重疊情況
3. 使用更快速的液相梯度
使用快速 10 min液相梯度重復本研究，以確認 Zeno SWATH DIA 工作流程在更快的液相梯度中鑒定蛋白質數量的提升倍數。相比于 Zeno DDA 方法， 45 min液相梯度，Zeno SWATH DIA 方法蛋白質鑒定量提升約2倍（圖 5）。隨著液相梯度加快， 使用Zeno SWATH DIA可獲得更大蛋白質鑒定增益，蛋白質鑒定數量增加到 2.5倍 -3 倍。因此，當進行大樣本分析時，更適合選用Zeno SWATH DIA工作流程。
圖5. 10 min和45 min液相梯度，
蛋白質和肽段鑒定數量的比較
文獻：
[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.
[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031.
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