實驗原理

CCK-8 (Cell Counting kit-8)試劑中含有WST-8:化學名: 2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基.苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸.二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臌產(chǎn)物(Formazan)， 生成的甲贊物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，可采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，間接反映活細胞數(shù)量。

常見問題FAQ

Q: CCK-8試劑盒檢測細胞增殖和毒性的優(yōu)點有哪些?

A: A: CCK- 8較傳統(tǒng)的MTT法優(yōu)點在于

1) MTT被線粒體內的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來溶解而CCK- 8產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可以省去后續(xù)的溶解步驟，

2)CCK-8檢測靈敏度更高，更加穩(wěn)定;

3)酚紅和血清對其測定無明顯影響;

4)不必去上清，不必洗,滌細胞更加簡便;

5)對細胞無明顯毒性，加入顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀板使檢測時間更加靈活，而且不影響細胞進行后續(xù)實驗。

Q :在做細胞的加藥實驗時，藥物對CCK-8測定是否有影響?如何解決?

A: 1)注意如果藥物具有還原性(如維生素C)，會和CCK-8發(fā)生顯色反應增加吸光度。

2)藥物中的金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%, 90%的顯色反應使靈敏度降級。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基(加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

3) 由于培養(yǎng)基中可能含有氧化還原反應的物質，在正式實驗之前建議使用一個孔作一 下檢測，有必要先確認培養(yǎng)基和CCK-8是否反應。-般正常的0D值應該在0.4以下。

Q: CCK-8如何設定空白對照?

A :在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8.培養(yǎng)-定的時間，測定450nm的吸光度即為空白對照。 在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時，還應考慮藥物的吸收可在不含細胞.加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8,培養(yǎng)-定的時間，測定450nm的吸光度作為空白對照。

Q: CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否-樣?

A:不一樣,懸浮細胞較貼壁細胞難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK 8培養(yǎng)1-4小時吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數(shù)量來解決。

Q :可否采用CCK-8法進行腫瘤細胞的基質黏附實驗?

A :可以，以層粘連蛋白(Ln)包被96孔板通過計算不同時間點孔板中貼壁細胞的數(shù)量反映細胞的黏附性。細胞的黏附性越強，則單位時間內貼于鋪有L n板底的細胞數(shù)量越多去除尚末貼壁的細胞后,應用CCK-8等方法計量細胞數(shù)量便可間接反映不同細胞或不同處理的細胞黏附能力的差異。

Q :可否采用CCK-8法進行藥物的IC50檢測?

A :可以，將細胞培養(yǎng)后按照不同濃度的藥物處理定時間后進行CCK-8檢測，根據(jù)吸光度繪制曲線，計算該藥物抑制細胞數(shù)量一半時的濃度(IC50)。

參考文獻

1. Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, et al. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as achromogenicindicator for NADH as well as cell viability. Talanta 1997.44(7): 1299-1305.

2. Ishiyama M, Tominaga H, Shiga M, et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicitywith a ，highlywater-soluble tetrazolium salt,neutral red andcrystal violet.Biol Pharm Bull1996, 19(11):1518-1520.

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