3.膜分離技術

在蛋白質純化過程中主要用到的膜分離技術多為超濾。在靜壓作用下降溶液通過孔徑非常小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質透過薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多數超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起而組成的。功能膜決定了膜的孔徑，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓力。超濾濃縮的優點是：操作條件溫和，無相變化，對生物活性物質沒有破壞。

超濾系統主要由料液貯罐、泵、超濾器、透過液收集罐組成，料液經泵打入超濾器，水及低分子量物質排出超濾器外，被濃縮的料液在料液貯罐、泵、及超濾器中循環。當料液濃縮至一定的倍數后即可作為進一步處理的濃縮料液。

超濾應用于蛋白質類物質的濃縮和脫鹽過程中時應注意以下問題：*，在超濾循環過程中，由于泵和葉輪與料液的摩擦放熱作用，料液的溫度會逐漸升高，會造成蛋白質分子的損失。因此，料液貯罐應加冷卻系統，并安裝自動測溫及控制系統。第二，某些酶的輔助因子散失為問題：一些酶含有輔助因子，其分子量小，超濾時易從透過液中排除掉，因而在超濾前或超濾后要添加一定濃度的的輔助因子。

還可將超濾與親和層析相結合以提高分離純度。其工作原理是：當溶液中欲被分離的蛋白質不受阻礙地通過超濾膜的孔隙時，如果在膜的一側結合著親和配基，該蛋白質就會與配基結合因而結聚在膜的這一側。不與配基結合的其他物質就將穿過孔而被帶走。再用適宜的洗脫劑將該蛋白質洗脫下來，洗脫液用于進一步的分離純化。

4.泡沫分離

原理：將氣體通入含多種組分的溶液中，由于這些組分的表面活性由差異，因此在溶液的表面，某些組分將形成泡沫，泡沫的穩定性取決于操作條件及溶液的生物學特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的組分種類及其含量與溶液中的不相同。這樣，溶液中的組分舅得以分離。

蛋白質較易吸附與氣液界面，這有利于其結構的穩定。泡沫分離過程是：蛋白質從主體溶液中擴散到氣液界面，該過程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子發生重排，一般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，一種是稀膜，另一種是濃膜，可能會發生由多個分子聚集在一起的現象。在氣液界面形成的蛋白質膜可以是單層的也可以是多層的。膜的類型取決于主體溶液及氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。

泡沫分離的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白質的濃度/zui初溶液中蛋白質濃度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白質的提取率/zui初的蛋白質質量），或使多組分混合物中某一組分的分配系數zui大。

二、抽提 沉淀

1.        鹽析

常用的鹽析劑是硫酸銨，其溶解度大、價格便宜。硫酸銨沉淀蛋白質的能力很強，其飽和溶液能使大多數的蛋白質沉淀下來。對酶沒有破壞作用。

pH的控制：應從酶的溶解度與穩定性兩個方面考慮，在酶等電點時其溶解度zui小易沉淀，但有些酶再等電點時穩定性較差，因此要選擇*pH值.一般要求在酶zui穩定的pH值的前提下再考慮zui適宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦確定*pH值后，在添加硫酸銨之前甲酸或堿調節好酶液的pH值，要盡量避免溶液pH值的波動以免破壞酶的穩定性。在添加硫酸銨時要注意攪拌，并注意硫酸銨的加入速度，一般是由少到多，緩慢加入，硫酸銨盡可能磨成細粉。

溫度的控制：有些酶在較高溫度下穩定性能較好，可在常溫下進行鹽析操作，而對于大多數酶，盡可能在低溫下操作。

酶液的凈置：加完硫酸銨后，酶液要靜置一段時間，使酶蛋白*沉淀下來，酶靜置后，就不要再加以攪拌。

2．有機溶劑沉淀

有機溶劑選擇：可用于酶蛋白沉淀的有機溶劑包括醇類物質等，如甲醇、乙醇、異丙醇。乙醇的親水性能較好，可防止蛋白質的變性，酶蛋白在其中的溶解度也較低。

有機溶劑沉淀操作：有機溶劑一般都使蛋白質變性，當溫度較高時變性蛋白質分子就會變成*失活。因此用有機溶劑處理時在0℃以下進行。用有機溶劑沉淀得到的酶蛋白不要放置過久，要盡快加水溶解。

3.聚合物絮凝劑沉淀     聚合物絮凝劑，如葡聚糖和聚乙二醇，與酶分子爭奪水分子，具有脫水作用使酶沉淀。聚乙二醇作為一種沉淀劑的優點是在水溶液中，其濃度可達到50%，濃度為6%-12%的蛋白質大都可以沉淀下來。這種試劑不需要低溫操作，而且對蛋白質的穩定還有一定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，故在離子交換吸附前不必去除。

4．用金屬離子和絡合物沉淀

酶和其他蛋白質都會形成金屬鹽，其溶解度較低。用金屬離子沉淀的缺點是酶與金屬離子相互作用后，可逆變化較差，尤其是用巰基衍生物，它結合的]金屬離子會催化酶變性而失活。

5．用特殊試劑沉淀法

用鏈霉素可選擇性去除核酸，從而使胞內酶沉淀出來。鏈霉素鹽（濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白質）對于選擇性沉淀核酸的效果比錳離子還要好，酶不易失活。