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2014-3-11 閱讀(1270)
Gaud Pinel1 ，Sandrine Roulet-Rochereau1 ，Marie-Hélène Le Breton1,2 ，
Sylvain Chéreau1 ，F(xiàn)abrice Monteau1 ，Paul Silcock3，與Bruno Le Bizec1
1Laboratoire d’ Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA)，ONIRIS，Nantes，F(xiàn)rance 法國(guó)LABERCA 化學(xué)實(shí)驗(yàn)室
2瑞士洛桑雀巢公司，雀巢研究中心
3 英國(guó)曼徹斯特沃特世公司
應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
牛注射了重組牛生長(zhǎng)激素，過(guò)幾天后檢測(cè)藥物在牛體內(nèi)的殘留。得到了明確的檢測(cè)結(jié)果，可用于此類(lèi)藥物的使用監(jiān)控。
■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測(cè)生物基質(zhì)中的重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ），符合2002/657/EC 要求。
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測(cè)動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物。
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來(lái)說(shuō)是十分重要的。
沃特世解決方案
■ ACQUITY UPLC，Xevo TQ MS
關(guān)鍵詞
■ rbST，reST ，生長(zhǎng)激素，食品安全
簡(jiǎn)介
動(dòng)物性食品安全控制是政府、法規(guī)機(jī)構(gòu)與組織的重要任務(wù)，應(yīng)該在食品進(jìn)入消費(fèi)環(huán)節(jié)之前就對(duì)食品安全進(jìn)行有效的檢測(cè)和控制。因?yàn)樯鲜泻蟮氖称钒踩录赡苡绊懴M(fèi)者信心與貿(mào)易。
重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ），又稱(chēng)為生長(zhǎng)激素，在一些國(guó)家通常作為豬或牛的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，將其用于乳牛可以增加牛奶產(chǎn)量1,2 。然而，生長(zhǎng)激素的使用有嚴(yán)格的法律規(guī)范，在歐盟國(guó)家是*禁用的3,4 。但是，這項(xiàng)法規(guī)的執(zhí)行面臨著很大的困難，主要是因?yàn)槿狈τ行У姆治龉ぞ邅?lái)檢測(cè)是否存在濫用該激素的情況。此分析的困難在于生長(zhǎng)激素本身是蛋白質(zhì)，且在生物基質(zhì)中濃度較低，而樣品基質(zhì)組成又十分復(fù)雜。至今為止，分析方法僅僅局限為酶聯(lián)免疫檢測(cè)，這個(gè)方法不能將天然存在的激素與重組激素分離開(kāi)來(lái)；盡管也有其它應(yīng)用報(bào)導(dǎo)，但都不能專(zhuān)屬性很強(qiáng)地檢測(cè)生理水平的重組牛生長(zhǎng)激素（rbST）5,6 。
直到zui近才開(kāi)發(fā)出了一項(xiàng)直接檢測(cè)生物基質(zhì)中重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ）的方法7,8 ，這個(gè)方法是將重組生長(zhǎng)激素用胰蛋白酶進(jìn)行水解，然后分析生長(zhǎng)激素專(zhuān)有的N-端肽鏈。事實(shí)上，天然激素的N-端氨基酸是丙氨酸，而重組激素的N-端氨基酸是甲硫氨酸。
此應(yīng)用文章展示了使用Waters® XevoTM TQ MS 分析注射了重組激素的動(dòng)物血漿樣品中的藥物。在注射后幾天進(jìn)行檢測(cè)，可清晰檢測(cè)出結(jié)果，展示了*水平。
實(shí)驗(yàn)部分
重組激素標(biāo)準(zhǔn)品
重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ）標(biāo)準(zhǔn)品與重組馬生長(zhǎng)激素（reST ）分別購(gòu)自哈勃UCLA 醫(yī)學(xué)中心國(guó)家激素與垂體項(xiàng)目（美國(guó)托蘭斯）以及Bresagen 有限公司（澳大利亞T hebarton ）。
樣本制備
重組牛生長(zhǎng)激素在血漿中的樣本提取、純化步驟依照文獻(xiàn)進(jìn)行。7,8
MS條件
MS系統(tǒng)：XEVO TQ MS
離子化模式：ESI+
毛細(xì)管電壓：3 kV
源溫度：150℃
脫溶劑溫度：550℃
脫溶劑氣速：800 L/小時(shí)
碰撞氣流速：0.15 mL/分
MRM方法參數(shù)
MRM通道通過(guò)Masslynx軟件中的InliStartTM行獨(dú)立的參數(shù)優(yōu)化，詳見(jiàn)表2。
結(jié)果與討論
LC/MS/MS條件優(yōu)化
ACQUITY UPLC系統(tǒng)對(duì)胰蛋白酶水解的N-端肽片段又很好的保留和分離效果，總運(yùn)行時(shí)間8分鐘，重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ）與重組馬生長(zhǎng)激素（reST ）的N-端保留時(shí)間分別為2.74和2.79分鐘（圖1）。
重組牛生長(zhǎng)激素（rbST）N-端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生雙電荷的離子[M+2H]2+=913 ，將此離子作為母離子。根據(jù)2002/657/EC歐盟委員會(huì)決議10 ，MRM方法中選擇了兩個(gè)子離子用于確證；重組馬生長(zhǎng)激素（reST ）作內(nèi)標(biāo)物，在樣品中的濃度為100 ng/mL ，其N(xiāo)-端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生三價(jià)電荷的離子[M+3H]3+= 623 ，將其作為母離子。
動(dòng)物注射生長(zhǎng)激素后體內(nèi)rbST的檢測(cè)
此方法用于檢測(cè)注射生長(zhǎng)激素后的動(dòng)物樣品。對(duì)奶牛一次性皮下注射500mg Lactatropin®藥物，然后取樣分析。
圖1 對(duì)10 ng/mL的rbST和reST標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，UPLC(ESI+)/MS/MS 的MRM特征離子信號(hào)分別為rbST 的N-端碎片離子為913>774和913>1047；reST的N-端碎片離子為623 >795和623 >530
圖2 使用UPLC（ESI+）/MS/MS分析注射藥物前（D0）與注射后兩天（D2）采集到的血漿樣本的的MRM特征離子信號(hào)圖譜
圖2顯示了注射藥物前采集到的血漿樣本得到的譜圖（D0）以及注射藥物兩天后血漿樣本的譜圖（D2）。
圖2的結(jié)果表明：可以在給動(dòng)物注射生長(zhǎng)激素兩天后在奶牛的血漿中檢測(cè)到rbST 。對(duì)采集到的特征信號(hào)分析表明此方法可以對(duì)生長(zhǎng)激素這個(gè)蛋白進(jìn)行明確的確證，符合2002/657/EC 的要求，同時(shí)確認(rèn)了檢測(cè)方法的靈敏度。
與預(yù)計(jì)的動(dòng)物血漿蛋白水平一致。基質(zhì)干擾幾乎檢測(cè)不到，在實(shí)際血漿樣本中的良好線性可保證對(duì)rbST 的進(jìn)一步相對(duì)定量結(jié)果，在注射生長(zhǎng)激素兩天后還可以檢測(cè)到血漿中50 ppb 的藥物，與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致7,11 。表3顯示了平行進(jìn)樣10 次得到的分析結(jié)果，這充分說(shuō)明Xevo TQ MS 在檢測(cè)低含量復(fù)雜樣品時(shí)能夠提供重復(fù)性好的數(shù)據(jù)。
結(jié)論
■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測(cè)生物基質(zhì)中的重組牛生長(zhǎng)激素（rbST ），符合2002/657/EC 要求
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測(cè)動(dòng)物血液中痕量的殘留激素藥物
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對(duì)于藥物監(jiān)控計(jì)劃實(shí)施中的常規(guī)分析來(lái)說(shuō)是十分重要的
參考文獻(xiàn)
[1] Burton JL, McBride BW, Block E, Glimm DR and Kennelly JJ. A review of bovine growth hormone. Canadian Journal of Animal Science. 1994; 74: 167-201.
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[3] Council Decision of 20 December 1994 amending Decision 90/218/ EEC concerning t he placing on t he market and administration of bovine somatotropin (BST). Official Journal of the European Communities. 1994/936/EC
[4] Council Decision of 17 December 1999 concerning the placing on the market and administration of bovine somatotropin (BST) and repealing Decision 90/218/EEC. Official Journal of the European Communities. 1999, 1999/879/EC.
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[6] Pinel G, Buon R, Aviat F, Larre C, André-Fontaine G, André F, and Le Bizec B. Recombinant bovine somatotropin misuse in cattle. Evaluation of western blotting and 2D electrophoresis methods on biological samples for the demonstration of its administration. Analytica Chimica Acta 2005, 529, 41-46.
[7] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Pinel G, Bailly-Chouriberry L, Ryc hen G, Jurjanz S, Goldmann T, and Le Bizec B. Direct determination of recombinant bovine somatotropin in plasma
from a treated goat. Rapid Communication in Mass Spectrometry. 2008; 22: 3130-3136.
[8] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Pinel G, Cesbron N and Le Bizec B. Elimination kinetic of recombinant somatotropin in bovine. Analytica Chimica Acta. 2009; 637: 121-127.
[9] Monteau F, Antignac JP, Pinel G, Silcock P, Hancock P, Le Bizec B. Xevo TQ MS:Adressing new challenges in the field of growth promoters in biological samples. Waters Application Note 2009.
[10] Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communities. 2002, 2002/657/EC.
[11] Le Breton M H, Rochereau-Roulet S, Chereau S, Pinel G, Delatour T and Le Bizec. Identification of cows treated with recombinant bovine somatotropine. Journal of Agricultural and Food Chemistry, DOI:10.1021/jf903032q.
