關于酶聯(lián)免疫試劑盒試劑的性質(zhì)
(一) 基本原理 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結(jié)合起來，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
(二) 用于標記的酶 用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用zui廣。
1.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量zui高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應的zui適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，zui高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數(shù)小時內(nèi)不改變,是目前國內(nèi)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)中zui常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘，zui大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，zui大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
2.堿性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產(chǎn)物呈，可溶，zui大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。
(三) 抗體的酶標記方法及標記效果測定
1.標記方法 良好的酶結(jié)合物取決于兩個條件：即價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用于實驗室的小批量制備。其標記程序為：將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對之透析（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進行測定后，冷凍干燥或低溫保存。
2.酶標抗體標記效果測定：測定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
(2) 結(jié)合物的定量測定 一般是對結(jié)合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定，然后按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可計算出標記抗體的摩爾（mol）比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結(jié)合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結(jié)合物溶液量
結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%
用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達 1000(g/ml時效果。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不*可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時。酶結(jié)合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時。(四) ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗,酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本類型、用途及操作程序