小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒的應用

背景[1-3]

小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中睪酮(T)的含量。

實驗原理:

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被睪酮(T)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的。顏色的深淺和樣品中的睪酮(T)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

樣本處理及要求

1、血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2、血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2-8°C 1000g離心20分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3、細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒

操作步驟：

1、從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2、設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3、樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4、除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7、每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。

小鼠睪酮(T)ELISA試劑盒的應用應用[4][5]

用于定坤丹對大、小鼠前列腺增生模型的影響研究

探究定坤丹對大鼠、小鼠前列腺增生的影響作用。通過對實驗動物前列腺重量的測定,計算實驗動物的前列腺臟器指數(shù),檢測模型大、小鼠血清中雌激素——雌二醇及雄激素——雙氫睪酮、睪酮含量,檢測實驗大鼠前列腺組織勻漿中前列腺酸性磷酸酶活力,觀察堿性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子及其m RNA、細胞凋亡基因Bax、Bcl-2等生長因子在前列腺組織中的表達,從病理學角度觀察并描述前列腺、腎臟等臟器的微觀改變,基于這些指標的變化,綜合性討論定坤丹對男性常見疾病——前列腺增生的影響作用。

方法:小鼠模型的復制:造模小鼠皮下注射丙酸睪酮5mg/kg,每日1次,連續(xù)3周,造前列腺增生模型,同時,每日1次,連續(xù)給藥3周,各組給予相應藥物,用等量的溶媒灌服給予模型及空白對照組,非那雄胺片組給予非那雄胺混懸液（1.25mg/kg）,癃閉舒膠囊組給予癃閉舒膠囊混懸液（450mg/kg）,大、中、小定坤丹劑量組分別給予大、中、小劑量（10.8g/kg、5.4g/kg、2.7g/kg）的定坤丹混懸液。于末次給藥后2h,小鼠眼眶取血,分離血清,按照試劑盒說明書測血清中T、DHT、E2水平;取前列腺、附睪、腎等組織,稱重,并計算相關臟器指數(shù);光鏡下觀察前列腺、附睪等臟器的組織形態(tài)變化。

大鼠模型的復制:摘除大鼠兩邊睪丸以去勢,待一周大鼠自然恢復后,大鼠給予丙酸睪酮注射液（4mg/kg）,每日1次,連續(xù)30d,造前列腺增生模型。模型復制成功后各組給予相應藥物,每日1次,連續(xù)給藥30d:把等量溶媒給予模型及空白對照組,非那雄胺片組給予0.83mg/kg的非那雄胺混懸液,癃閉舒膠囊組給予300mg/kg的癃閉舒膠囊混懸液,大、中、小定坤丹劑量組分別給予大、中、小劑量（7.2g/kg、3.6g/kg、1.8g/kg）的定坤丹混懸液。

于末次給藥后2h,眼眶取血,離心,分離血清,按照試劑盒說明書測血清中T、DHT、E2水平;計算前列腺指數(shù);測定前列腺組織勻漿中PACP、NOS、SOD、MDA水平,光鏡下觀察各組前列腺等臟器的形態(tài)變化,觀察前列腺組織中b FGF、TGF-β1、EGF、IGF-Ⅰ、細胞凋亡基因Bax、Bcl-2及Ki67的免疫組化表達情況。結果:丙酸睪酮法誘導非去勢小鼠前列腺增生模型成功,大、中、小劑量定坤丹組顯著降低小鼠前列腺臟器指數(shù);顯著降低小鼠血清中T、DHT含量,E2含量顯著或明顯升高;顯著改善小鼠前列腺增生病理變化。

丙酸睪酮法誘導去勢大鼠前列腺增生模型成功,大、中、小劑量定坤丹組顯著降低大鼠前列腺臟器指數(shù);顯著降低大鼠血清中T、DHT含量,E2含量顯著或明顯升高;大、中、小劑量定坤丹組均可顯著降低模型大鼠前列腺中的PACP活力,顯著升高TNOS、i NOS水平、TGF-β平均光密度,顯著或明顯降低大鼠前列腺MDA水平、b FGF、EGF、Bcl-2、Ki-67平均光密度、b FGF m RNA表達,顯著或明顯升高大鼠前列腺SOD活力、Bax平均光密度、TGF-βm RNA表達。大、中劑量定坤丹組可顯著或明顯降低模型大鼠前列腺中IGF-I平均光密度,小劑量定坤丹組有降低IGF-I平均光密度的趨勢;顯著改善小、大鼠前列腺增生病理變化。