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線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC0940
規格：25T/24S、50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

25T溶液的配制：
工作液的配制：臨用前取試劑一、試劑二、試劑三，將試劑二和試劑三依次轉移到試劑一中混合溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。
50T溶液的配制：

1. 工作液的配制：臨用前取一瓶試劑一、一支試劑二和一支試劑三，將試劑二和試劑三依次轉移到試劑一中混合溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融。

產品說明：
線粒體復合體Ⅳ又稱細*色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細*色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧生成水。還原型細*色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復合體Ⅳ催化還原型細*色素C生成氧化型細*色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。4 ℃ 600g離心10min。

2. 將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000g離心15min。

3. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率20%，超聲5秒，間隔10秒，重復15次），用于復合體Ⅳ酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。

二、測定步驟

1. 可見分光光度計預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。

2. 將工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育15min；用不完的試劑4℃可保存一周；

3. 樣本測定（在1mL玻璃比色皿中分別加入）

立即混勻，分別記錄測定管和空白管550nm處初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，測定管的記為A1測定管，A2測定管，空白管的記為A1空白管，A2空白管。計算ΔA1=A1測定管-A2測定管，ΔA2=A1空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。
三、復合體Ⅳ活力單位的計算
按樣本蛋白濃度計算：
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
V反總：反應體系總體積，1.05×10^-3L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL； T：反應時間，1min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，需自行測定；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
注意事項：

1. 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于1），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計算結果時注意乘以稀釋倍數。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數），使A1-A2小于0.2，可提高檢測靈敏度；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2. 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測定樣本蛋白濃度時需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨測量）。

3. 本試劑盒試劑足夠完成50管反應。

4. 附:使用樣本重量計算公式：（檢測樣本數為50T/24S）

A、上清中復合體Ⅳ活力的計算：
單位定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=[ΔA上清×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=1099×ΔA上清÷W
ΔA上清：上清測定值；V反總：反應體系總體積，1.05×10^-3L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V提取：加入提取液體積，1.0mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中復合體Ⅳ活力的計算：
單位定義：每g組織在反應體系中每分鐘催化降解1nmol還原型細*色素C定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=[ΔA沉淀×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V樣)÷T=440×ΔA沉淀÷W
ΔA沉淀：沉淀測定值；V反總：反應體系總體積，1.05×10^-3L；ε：細*色素C摩爾消光系數，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V提取：加入提取液體積，0.4mL； W：樣本質量，g；T：反應時間，1min；10⁹：單位換算系數，1mol=10⁹nmol。
C、樣本復合體Ⅳ總活力的計算：
樣本復合體Ⅳ總活力即為上清中復合體Ⅳ活力與沉淀中復合體Ⅳ活力之和。
按樣本質量計算：復合體Ⅳ（U/g 質量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
實驗實例：

1. 取0.1g兔肝臟進行樣本處理，按照測定步驟操作，測得ΔA2=A1空白管-A2空白管=0.79-0.781=0.009，上清液的ΔA1=A1測定管-A2測定管=0.822-0.792=0.03，ΔA上清=ΔA1-ΔA2=0.03-0.009=0.021，沉淀中的ΔA1=A1測定管-A2測定管=0.992-0.792=0.2，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA2=0.2-0.009=0.191，按樣本質量計算：

上清液中復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=1099×ΔA上清÷W=1099×0.021÷0.1=230.79 U/g 質量
沉淀中復合體Ⅳ活力(U/g 質量)=440×ΔA沉淀÷W=440×0.191÷0.1 =840.4 U/g質量
則樣本復合體Ⅳ總活力（U/g質量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
=1099×0.021÷0.1+440×0.191÷0.1=1071.19 U/g 質量。
相關發表文獻：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

2. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018;(IF8.274)

3. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

4. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

5. Li N, Qin S, Xie L, et al. Elevated Serum Potassium Concentration Alleviates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via Mitochondrial Preservation[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 48(4): 1664-1674.

參考文獻：

1. Willis J H, Capaldi R A, Huigsloot M, et al. Isolated deficiencies of OXPHOS complexes I and IV are identified accurately and quickly by simple enzyme activity immunocapture assays[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2009, 1787(5): 533-538.

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