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Cell總結(jié)CRISPR重要綜述與研究成果
閱讀：953 發(fā)布時間：2015-10-28作為新一代基因組編輯技術(shù)先鋒，CRISPR炙手可熱，這種zui初被微生物學家用以了解細菌免疫力的技術(shù)方法在過去的5年里，研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)而將CRISPR/Cas9發(fā)展為生物學研究的有力工具。CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，已經(jīng)加速了科學研究，并提高了研究人員產(chǎn)生遺傳模型的能力。 立即索取BioTek多功能酶標儀的詳細資料 “Cell Press Selections"是由Cell出版社推出的一份推薦文章集合手冊，主要介紹某個生命科學研究領(lǐng)域的進展及突出成果。相關(guān)特輯內(nèi)容包括研究論文，評論性文章以及snapshots，涉及了同一領(lǐng)域的方方面面，更為重要的是這些文章由贊助商贊助，可以免費獲取。
作為新一代基因組編輯技術(shù)先鋒，CRISPR炙手可熱，這種zui初被微生物學家用以了解細菌免疫力的技術(shù)方法在過去的5年里，研究人員已經(jīng)轉(zhuǎn)而將CRISPR/Cas9發(fā)展為生物學研究的有力工具。CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)，已經(jīng)加速了科學研究，并提高了研究人員產(chǎn)生遺傳模型的能力。
自2014年CRISPR技術(shù)應(yīng)用備受關(guān)注以來，目前已經(jīng)有超過1200篇相關(guān)的文章發(fā)布，許多實驗室都在利用CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)分析各自的問題，從小鼠到蚊子，CRISPR技術(shù)為基因組學研究領(lǐng)域帶來了一陣旋風，取得了幾年前我們都不敢想象的成果。
在特輯：“CRISPR：The Next Generation"介紹了多篇綜述與研究報道，其中包括：
上篇： Cell特輯：CRISPR翻開嶄新的一頁
Efficient Multiplexed Integration of Synergistic Alleles and Metabolic Pathways in Yeasts via CRISPR-Cas
來自美國Amyris Inc的研究人員，在酵母中實現(xiàn)了快速便捷的多點突變和大片段缺失構(gòu)建。與之前的復雜操作相比，這讓酵母中的基因供能研究變得更加快速和高通量化。生物通 www.ebiotrade。。ｃｏｍ
研究人員使用一種模塊化的gRNA傳遞策略，來實現(xiàn)點突變的多元整合，包括在三個位點同時引入五個修改，以賦予菌株增強的耐醇性。
研究人員表明，一個單一線性化質(zhì)粒（攜帶多重PCR生產(chǎn)的引導RNA和供體DNA盒）的共轉(zhuǎn)化，可促進點突變和大片段缺失構(gòu)建的集成。這種技術(shù)可讓研究人員以64%的效率，恢復無標記的三重工程事件，而不需要選擇所有g(shù)RNA的表達。gRNA盒可以通過PCR很容易地產(chǎn)生，并在任何組合中傳遞。
Cell子刊：酵母中的基因組編輯
CRISPR-Cas9-Mediated Genetic Screening in Mice with Haploid Embryonic Stem Cells Carrying a Guide RNA Library
能代替精子細胞使用的單倍體細胞系的建立為獲取遺傳編輯的動物模型提供了一種新的手段。然而，之前的研究顯示，半克隆小鼠的出生效率低（4.5%左右），而且約一半的半克隆小鼠出現(xiàn)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象。分析原因發(fā)現(xiàn)，原本在精子細胞中不表達的雄性印記基因H19在單倍體細胞和發(fā)育遲緩的半克隆小鼠中出現(xiàn)高表達的現(xiàn)象，這暗示印記基因的異常表達可能是導致半克隆小鼠胚胎發(fā)育異常的關(guān)鍵原因，通過調(diào)控印記基因的表達有可能提高半克隆小鼠的出生效率。
“類精子細胞"的單倍體細胞系的建立使得利用這一細胞快速制備遺傳編輯小鼠模型成為可能。為此，研究人員先后在H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細胞中進行了多基因的敲除和敲入，建立了攜帶Tet1/Tet2/Tet3三基因敲除、P56/P63/P73三基因敲除以及Tet1-EGFP/Tet2-mCherry/Tet3-ECFP三基因敲入的細胞系，并證明這些細胞能穩(wěn)定支持半克隆小鼠的產(chǎn)生。
zui近，CRISPR-Cas9文庫被應(yīng)用到人和小鼠的細胞中進行了全基因組水平的遺傳篩選。研究人員進一步推測，如果H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細胞能夠攜帶CRISPR-Cas9文庫，讓單個的細胞攜帶一個sgRNA和Cas9核酸酶，通過注入卵子中則可以批量產(chǎn)生攜帶不同突變基因的半克隆小鼠，從而使得小鼠個體水平的遺傳篩選成為可能。通過實驗，研究人員驗證了這一設(shè)想，從而*哺乳動物在個體水平進行遺傳篩選的空白，為遺傳發(fā)育研究提供了新的體系。
Genome Engineering with CRISPR-Cas9 in the Mosquito Aedes aegypti
美國洛克菲勒大學的研究人員利用基因編輯技術(shù)（CRISPR-Cas9），掌握了致命的“埃及伊蚊"如何傳播疾病，叮咬人類等信息，有望對其進行技術(shù)干預(yù)。
研究人員發(fā)現(xiàn)在這種蚊子的幾個基因上，用CRISPR-Cas9技術(shù)有效產(chǎn)生靶向基因突變和干預(yù)效果。這個項目的近期目標是了解埃及伊蚊作為疾病載體，其不同基因如何有效運作并產(chǎn)生免疫系統(tǒng)。
Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis
研究人員利用Broad研究所的“小鼠全基因組CRISPR敲除文庫A" (mGeCKOa)(靶向小鼠基因組中所有基因的CRISPR向?qū)NA匯合文庫)，以及Cas9 DNA切割酶處理了來自非小細胞肺癌(NSCLC)小鼠模型的細胞。這一系統(tǒng)將突變導入到了一些特定基因中，破壞了它們的序列并阻止了這些基因生成蛋白。這一方法確保了在每個細胞中只有一個基因被敲除，在培養(yǎng)的異質(zhì)細胞群中則以小鼠基因組中的所有基因作為靶標。研究人員隨后將這些細胞移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)用這一基因敲除文庫處理的一些細胞形成了高轉(zhuǎn)移性腫瘤。
利用新一代測序，科學家們鑒別出了在原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶中敲除的基因，指出了一些基因有可能是通常抑制腫瘤生長的腫瘤抑制基因，當敲除它們時會促進腫瘤生長。
研究結(jié)果突出顯示了一些在人類腫瘤中*的腫瘤抑制基因，包括Pten、Cdkn2a和Nf2，也涵蓋了一些從前未與癌癥關(guān)聯(lián)的基因。出乎意料地是，這一篩查系統(tǒng)還揭示了幾個microRNAs。
張鋒博士Cell：讓CRISPR在癌癥領(lǐng)域大放異彩
A CRISPR/Cas9 Vector System for Tissue-Specific Gene Disruption in Zebrafish
CRISPR/Cas9技術(shù)作為基因編輯工具目前已在多個平臺和系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用，大大方便了在體內(nèi)和體外對靶向基因進行敲除操作。在該研究中，研究人員開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas9技術(shù)的載體系統(tǒng)，在斑馬魚上實現(xiàn)了組織特異性基因敲除。他們在斑馬魚中，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在單細胞胚胎階段通過簡單地注射導向RNA(gRNA)和Cas9 mRNA快速獲得基因敲除斑馬魚。為證明該項技術(shù)的可應(yīng)用性，研究人員構(gòu)建了攜帶gata1啟動子的載體，驅(qū)動Cas9表達，在紅細胞中特異性敲除了參與血紅素合成的urod基因。通過靶向Urod基因，研究人員在斑馬魚胚胎中觀察到攜帶紅色熒光的紅細胞，重復了在yquem突變的斑馬魚中觀察到的表型。雖然F0代胚胎中出現(xiàn)鑲嵌基因中斷，但在F1代斑馬魚中，這種表型非常明顯。
這套基于CRISPR的載體系統(tǒng)為在斑馬魚上實現(xiàn)組織特異性基因敲除提供了一種便捷的方法，大大拓寬了在斑馬魚中進行功能缺失的研究范圍，具有重要意義。
Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening生物通 www.ebiotrade。。ｃｏｍ
研究人員在一期《發(fā)育細胞》（Developmental Cell）雜志上，詳細描述了稱作為CRISPR-EATING的過程。
在原理論證研究中，研究人員將常見腸道細菌——大腸桿菌的整個基因組變成了覆蓋88%細菌基因組的包含4萬個向?qū)NAs的文庫。每個向?qū)NA都是一個長20個RNA堿基對的片段：CRISPR-Cas9利用它作為模板來找出互補DNA結(jié)合并進行切割。
這些文庫可用于傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9編輯中靶向基因組中任何特定的DNA序列并切割它，當研究人員試圖闡明某一基因的功能時就會這樣做：即敲除這一基因，看看細胞中會發(fā)生什么不好的事情。這可以幫助確定疾病的原因。這一稱作為遺傳篩查的過程要分批來完成：將成千上萬的探針各自導入培養(yǎng)板上數(shù)十萬細胞的單個細胞中。