在保證ELISA有效檢測病原菌的前提下，快速、方便也是人生長激素ELISA的必要條件。人生長激素ELISA從加入待測抗原到得出結(jié)果，檢測大腸桿菌O157:H7共需要5h左右，而間接ELISA則需要7h(包被37℃，2h)或者17h(包被4℃guo夜)。本論文篩選出的人生長激素ELISA檢測大腸桿菌O157:H7省去封閉這一步驟。在間接ELISA測定抗原中，封閉一般是bi不可少的，因?yàn)榘徊煌瑵舛瓤乖灰欢梢詗an全覆蓋固相載體表面，如果不封閉，很可能使隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗直接被吸附到固相載體上，產(chǎn)生非特異性顯色而使檢測結(jié)果偏高。但是對(duì)于雙抗體夾心ELISA來說，在包被捕獲抗體時(shí)已經(jīng)使固相載體飽和，已經(jīng)沒有多余的吸附力來吸附隨后加入的特異性抗體和酶標(biāo)二抗，這都說明了人生長激素ELISA有不需要封閉的可能，通過正交試驗(yàn)結(jié)果也證明不封閉可以達(dá)到理想實(shí)驗(yàn)效果，而且還縮短了整個(gè)檢測流程和時(shí)間，說明只要酶標(biāo)記物是高活性的并且操作時(shí)洗滌che底，不經(jīng)封閉也可得到滿意結(jié)果。人生長激素ELISA檢測法的特異性和靈敏性抗原抗體的結(jié)合實(shí)際上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間，由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。但這種特異性并不是的，假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌O157:H7及其他菌株共10株作為抗原用來檢測本方法的特異性，結(jié)果顯示大腸桿菌O157:H7呈明顯陽性反應(yīng)，其余各菌株均呈陰性反應(yīng)，說明本方法對(duì)大腸桿菌O157:H7具有明顯的檢測特異性，而對(duì)所測定的其它菌株無交叉反應(yīng)。
人生長激素ELISA操作步驟
⑴將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
⑵加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
⑶加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
⑷加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。
