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北京西美杰科技有限公司
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Mirus Label IT®高效一步法用于體內和體外核酸標記的新技術
2024-4-10 閱讀(266)
細胞轉染在科學研究中扮演著十分重要的角色，但也是最容易被忽略的一環。轉染效率的高低不僅影響實驗結果，甚至可能導致得到的實驗結果是無效的。在多種類型核酸的細胞轉染實驗中，研究者們常需要進一步優化轉染條件以達到轉染效率，特別是較難轉染的細胞，而針對特定細胞類型選擇對應專業化的轉染試劑只是邁向轉染實驗成功的第一步。
成立于1995年的Mirus Bio，專注及深耕核酸遞轉領域多年，從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別、可用于AAV和LV生產的TransIT-VirusGEN® (產品年鑒請見圖1)。直至文稿發布時，使用Mirus產品發表文章已超過1萬篇，并且發表文章及Mirus數據庫涵蓋了超過1200種細胞類型。
圖1 Mirus產品年鑒
在細胞轉染實驗中，研究者們常常會忽略轉染效率/成功率的評估，那么是否有對應技術或者方法允許實時監測DNA/RNA的成功遞送以及細胞內的分布狀態呢？Mirus Bio Label IT® 核酸標記試劑盒為廣大的科研工作者提供了一個方向。Label IT® 核酸標記試劑盒可對任何類型核酸，進行高效、直接的標記，并且為on-step的實驗操作。基于非酶反應的標記方法，在不損傷核酸完整性、不影響基因表達的前提下，將選擇的標記 (熒光、生物素等)以共價的方式連接到核酸上。
Label IT® 試劑盒有多種標簽可供選擇，包括 Cy®3、Cy®5、CX-羅丹明、TM-羅丹明、熒光素、MFP488、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT® 核酸修飾試劑盒（胺）也可用于基于胺的功能基團進行DNA或RNA修飾。產品特點如下：
· 可用于標記任何DNA或RNA模板——適用于多種應用 (In vitro & in vivo)，如Crispr基因編輯、核酸遞轉、RNA干擾/表達實驗、FISH、Microarray等；
· 一步法標記——簡單、輕松即可完成穩定的模版標記反應；
· 可根據實驗需求或應用，調節標記的密度——以獲得最佳檢測標記 DNA 或RNA 的靈敏度；
· 基于共價化學反應——對核酸殘基的修飾為無損傷的，是多種科研應用的理想選擇。
· 什么是核酸標記？如何標記核酸？如何檢測？
絕大多數基于分子和生物學的In vitro 及 in vivo研究都依賴于核酸的標記或標簽，理想情況下，此類標記或標簽不會影響核酸功能以及研究結果。因此，也發展出來多種核酸標記方式，大致可以歸為以下兩類：
- 化學標記法：基于結合核酸的反應基團，比如Mirus Label IT® 核酸標記試劑盒屬于此類，并且整個反應過程并不需要酶的參與。
(1) 標簽/標記 (綠色區域)；
(2) Linker，與核酸進行靜電相互作用 (黃色區域)；
(3) Label IT® 試劑以共價形式連接到核酸中活性雜原子的烷基化基團(藍色區域)。
圖2. Label IT®標記分子示意圖
- 基于酶反應標記法：通過酶促反應，在該反應過程中加入標記修飾的核酸。
當待研究的核酸加入標記后，可通過以下兩種方式進行檢測：
- 直接檢測：這時，標記的核酸中包含了可用于光學、發光或產生熒光信號的報告分子。
- 間接檢測：標記的核酸帶有標簽或標記，該標記需要特異性的結合報告偶聯分子，如生物素結合帶有熒光標記的鏈霉親和素，結合帶有熒光標記的特異性抗體等。
· Label IT® 核酸標記試劑盒——不改變核酸結構功能
基因沉默相關功能研究在分子和細胞生物學中發揮著重要作用，化學轉染也在該研究領域扮演者重要角色。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA)，常作為研究各種類型細胞中蛋白功能核酸類型，通過有效的knockdown從而影響基因表達。那么，加入Label IT®標記的核酸，是否會改變核酸結構，從而影響到后續實驗結果呢？
評估測試使用Label IT® siRNA Tracker™ 試劑盒，將相同siRNA加入不同標記 (CyTM3, CyTM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒有標記siRNA，轉染后，可通過熒光顯微鏡觀察到帶有標記的siRNA。基因表達結果顯示，帶有不同標記的siRNA，其目的基因表達水平近似，意味著加入Label IT®標記的核酸，并不影響目的基因表達及功能 (圖3)。
圖3 Label IT® siRNA Tracker™ 試劑盒評估測試
· Label IT® 核酸標記試劑盒——前沿應用舉例
應用一：使用Label IT®技術，富集CRISPR'd細胞
Nasri 和 Mir 等人在文章中闡述了如何通過 Label IT® 技術，富集 CRISPR/Cas編輯成功的細胞。基因組編輯實驗面臨最大的挑戰之一是如何從未編輯的細胞中成功的篩選/富集出成功編輯的細胞，特別當未被編輯的細胞相對于成功編輯的細胞，具有生長/增殖優勢，使得細胞篩選變得更加困難。
為了高效的區分經過基因編輯及未編輯的細胞，作者在CRISPR引導RNA ( gRNA) 與 Cas9 形成復合物及轉染細胞前，使用Label IT®對gRNA進行了熒光標記，實驗流程示意圖如下：
研究結果表明，使用Label IT®標記的gRNA 不會影響基因編輯效率，并且可通過熒光分選/富集成功編輯的細胞群。進一步地，研究者們將該 CRISPR 實驗流程應用于針對多種細胞類型的GADD45B基因編輯實驗。根據細胞類型的不同，經過Label IT®標記的細胞亞群中，其成功編輯細胞占比相對于總細胞群體提了15-40%。
發表文章信息：
標題: Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者: Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志: Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI: 10.1182/bloodadvances.2017015511
應用二：使用Label IT®技術，聚焦于免疫系統研究
Label IT® 核酸標記技術可用于一種新型疫苗注射方法-微針陣列(microneedle array, MNA)的表征研究。傳統的疫苗注射方法是通過 3 厘米以上長度的針頭進行皮下注射，而微針陣列則是由微米級針頭所組成(示意圖如下)，以無痛的方式細微的的穿透皮膚，進入到富含免疫細胞群，可減少患者的不適感。
為了提高疫苗的效力(efficacy)，通常會將免疫刺激分子或 "激動劑(agonists) "與疫苗的靶標或抗原一同加入疫苗制劑中。Edwards 等人的研究表明，雙鏈 polyIC RNA 和單鏈 CpG DNA 寡核苷酸可作為微陣列中的激動劑(agonists)。并且，研究者們認為帶負電荷的核酸激動劑(agonists)和帶正電荷的抗原之間的靜電相互作用，幫助了微陣列的組裝。通過使用 Label IT® Cy®3 和 Cy®5 ，分別針對以上兩種核酸類型進行熒光標記，方便用于查看標記核酸在微針上的分布，這樣就允許了研究者們按照所需要的特定比例，將兩種激動劑均一的加入到微陣中，從而使得精確的調整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應成為可能。
發表文章信息：
標題: Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者: Camilla Edwards, Robert Oakes et al.
雜志: Nanoscale, Volume 15, Apr 2023.
DOI: 10.1039/D3NR00333G
· Label IT® 核酸標記試劑盒-產品選擇
Label IT®試劑盒共有以下四種形式可供選擇，以應對研究人員核酸標記實驗的不同應用場景需求：
· Label IT® Nucleic Acid Labeling Kits
· Label IT®Tracker™ Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
· Label IT® siRNA Tracker™ Intracellular Localization Kits
· Label IT® Nucleic Acid Modifying Kits
下表總結了不同種類Label IT®試劑盒區別：
Label IT® Nucleic Acid Labeling | Label IT® Tracker™ | Label IT® siRNA Tracker™ | Label IT® Nucleic Acid Labeling Modifying | |
應用 | in vitro & in vivo應用的多種類型核酸標記 | in vitro & in vivo質粒追蹤實驗 | in vitro & in vivo siRNA追蹤實驗 | DNA氨基修飾 |
試劑盒組分 | Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer Reagent D1& Buffer N1 G50 Microspin Columns | Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer | Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer siRNA Dilution Buffer | Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer Reagent D1& Buffer N1 G50 Microspin Columns |
Label IT® : 核酸比例 | 1 µl : 1 µg | 0.5 µl : 1 µg | 1 µl : 1 µg | 0.5 µl : 1 µg |
標記密度 | 每20-60 bp 1個標記 | 每60-140 bp 1個標記 | 每15-40 bp 1個標記 | 每20-60 bp 1個標記 |
標記物類型 | Cy®3 Cy®5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 MFP488 DNP | Cy®3 Cy®5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 | Cy®3 Cy®5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 | 氨基 |
試劑盒規格 | 25 µl 100 µl | 50 µl | 50 µl | 25 µl 100 µl |
· 更多有關產品常疑問FAQ，請查看鏈接
· Label IT® 核酸標記試劑盒-實驗優化之核酸標記密度
理想的密度取決于被標記的核酸類型及下游應用。在需要直接追蹤核酸的實驗中，更適合較高的核酸標記密度；而在想要維持/完整的還原標記核酸的生物學功能的實驗中，則更加適合較低的標記密度。使用 Label IT® 核酸標記技術，可以輕松調整到理想的標記密度。
Label IT® 試劑與核酸的比例(v:w)的改變與標記密度呈線性相關性(圖 4)。例如，按照說明的初次實驗建議，需加入 5 µl Label IT® 試劑標記 5 µg DNA，此時v:w比例為1:1。在保證孵育時間和 DNA 量不變的條件下，如將 Label IT® 試劑的量降低為 2.5 µl 或 增加到10 µl，標記密度將分別降低一半或增加一倍。
實驗Tips：使用過高的 Label IT® 試劑量（超過建議量的 4 倍），可能會導致核酸裂解或引起 Label IT® 熒光基團淬滅。
核酸標記密度與所使用的 Label IT® 試劑量及反應的孵育時間呈正線性相關。可通過調整反應中 Label IT® 試劑的用量或反應的孵育時間 (孵育溫度仍為37℃)，可輕松靈活的調整到所需要的理想標記密度。
圖4. 核酸標記密度與Label IT®試劑用量和反應孵育時間成正比
實驗Tips：如何計算核酸標記密度，詳細實驗步驟及方法請見“Calculate Nucleic Acid Labeling Density"。
Mirus Bio公司介紹
Mirus成立于1995年，始終秉承著為基因遞轉提供最佳方法及更高效的工具。憑借超過 25 年轉染領域的深根細作，獲得了多項技術突破，已成為核酸遞送領域值得信賴的品牌。Mirus科學家團隊不斷突破轉染技術的極限，推出了VirusGEN®轉染試劑與RevIT™增強劑，進一步提升AAV/Lv產量，助力推動生物治療藥物的降本增效，為CGT領域客戶賦能。
北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區總代理，始終秉承著專業、嚴謹的態度為客戶提供優質的產品與服務，Mirus熱銷轉染產品常備現貨。北京西美杰是 Mirus代理， Mirus中國代理， Mirus北京代理， Mirus總代理， Mirus上海代理，， Mirus西北代理， Mirus西南代理， Mirus東北代理， Mirus華北代理， Mirus華南代理， Mirus華中代理，負責 Mirus在中國的相關業務。
