FALCON-即時產生熒光壽命成像 (FLIM)
我們經常聽到別人抱怨熒光壽命測量：“壽命分析太復雜了！"但這種情況即將改變！新技術和新概念的發展促進了數據評估，意味著熒光壽命成像(FLIM)的速度提高了10倍，可以媲美標準共聚焦成像，且操作簡單。
圖為小鼠胚胎的壽命圖像。722個視野拼接，擬合出4個獨立的特征壽命。采集時間約1小時-傳統方法約1天。
熒光過程提供了兩個用于成像的測量參數：強度和熒光壽命。熒光壽命是指分子停留在激發態的時間。可以通過觀察足夠大量的激發-發射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。我們可以測量圖像中所有像素的典型壽命，并將這些數字記入數組元素。那就是熒光壽命成像[1](FLIM，也稱為τ-映射）。典型的熒光壽命范圍在0.2到20納秒之間。
熒光壽命與熒光染料的濃度無關。無論樣品結構僅有零星熒光染料還是載滿熒光染料：壽命信號始終相同，并表明在同一環境中存在相同的熒光染料。因此，熒光壽命不受光漂白的影響。樣品深處的圖像將比表面圖像暗得多——但壽命并沒有改變。這是壽命測定的主要優勢。
如果分子環境刺激激發態衰變而不發射光子，則熒光強度會降低（淬滅）。熒光淬滅是一條單獨的發射路徑，因此在動力學上與熒光過程形成競爭關系。激發態存儲現在可以通過一個以上的過程衰變，從而縮短熒光壽命。這種壽命的改變可用于收集分子環境的信息。
一種特殊類型的淬滅是將激發能量以非輻射的方式傳遞到相鄰的不同熒光染料中：“熒光共振能量轉移"[2]，FRET。此時，不僅第一個熒光染料（供體）變暗，壽命變短，而且第二個熒光染料（受體）在“錯誤的"激發顏色下開始發光。由于這種效果的產生需要兩種熒光染料（小于10 nm）的密切接觸，因此將其用作研究分子相互作用的“分子標尺"。它也是許多現代FRET生物傳感器的基礎，專門用于測量活體樣本中的各種細胞內參數：Ca2+或其他離子濃度追蹤、酸堿度、極性和電位測量、蛋白質相互作用等。
FLIM的黃金標準是“時間相關單光子計數"[3]TCSPC，它與多光子共聚焦顯微鏡兼容。用光脈沖照射樣本，測量發射光子到達的時間。為重建典型的壽命，這種測量要在同一樣本位置重復幾次。需要測量幾百個事件才能達到大約10%的準確度。然后將數據按時間分組放入直方圖中。然后對該直方圖中隨時間出現的衰變進行數學擬合，并直接提供所需的熒光壽命（圖01a-c）。
圖01a：測量激光脈沖激發（藍色箭頭）后發射光子（紅色箭頭）的到達時間t?。此處繪制了5個測量值。
圖01b：到達時間的直方圖，包括上述示例中五個事件的集合。大多數計數#時間都很短。直方圖用指數衰減（紅色）來擬合。
圖01c：擬合顯示，例如，兩個單衰變（藍色和綠色曲線），衰變時間t?和t?，振幅為A?和A?。求和將再次獲得紅色衰變曲線。
這個過程是zuijing確的，并可以重復，但需要一定時間。測量后，系統在大約100納秒的死區時間內準備好進行下一次發射。要錄入400個事件，測量一個像素的時間達40微秒。一張512x512的圖像大約需要12秒，這無法適應快速變化和移動的生命系統。
目前的解決方案需要一定的技術靈活性、復雜的手動數據處理和jing密的評價程序。
徠卡顯微系統推出了一款FLIM顯微鏡：FALCON（FAst Lifetime CONtrast）熒光壽命成像系統可以解決以上所有問題。
本系統基于混合探測器（HyD）[4]，是理想的壽命成像傳感器，具有極短的死區時間。激光脈沖序列和發射光子脈沖都以高采樣率即刻實現數字化，將測得的距離直接輸入數據池。這些到達時間用于輸出“快速-FLIM"圖像。
新方法允許使用大多數激光脈沖，并應用一個過濾器來限制只有一個光子發射的脈沖事件。在第一個光子到達后不久，隨即到達的光子不可避免的會被忽略，可以通過智能數學方法進行校正。基于以上種種因素，圖像記錄速度提高了10倍。
所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦顯微鏡中。記錄FLIM就像激活一個額外的通道。用于3D、時間和光譜系列的多維采集模式可立即用于FLIM成像。例如標題圖像：具有經典組織學染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR軟件，創建了722個圖塊，每個圖塊為512x512像素的圖稿。原始圖像有1.9億像素。用四個指數對壽命進行擬合，并以顏色進行編碼。
在功能成像領域，我們希望監測小分子、離子或電勢的動態變化。這通常是用熒光探針完成的。其中多數顯示出強度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質，并在活細胞中表達這些構建體。該技術利用FRET跟蹤活細胞中的分子相互作用。最為現代化的工具是蛋白質或肽，它們與所需的分析物（例如Ca2+）結合，并裝飾有一對進行FRET的熒光蛋白。結合分析物后，肽將發生構象變化，FRET將出現或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結合蛋白Epac[5]。
圖02：用游離態的cAMP刺激培養細胞，并用Epac FRET-生物傳感器進行監測。在紅色圓圈區域分析信號（平均到達時間t?）。隨時間變化的圖示見底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。
FALCON的技術速度夠快，可以在活細胞中使用化學傳感器和FRET生物傳感器進行熒光壽命成像。
無染色應用是分析活體材料中的內源性熒光。例如：癌細胞抑制細胞呼吸，傾向于無氧糖酵解（瓦博格效應），這會導致積累更高濃度的熒光NADH[6]。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進行深度成像。同樣，壽命對比度要可靠得多，因為深層的顯微鏡會受到吸收和陰影效應的影響，從而使強度信號失真。
傳統意義上，不同的熒光染料以其不同的顏色來區分。如果激發和發射相同，仍然可以通過壽命進行區分。發射強度和壽命可以作為顏色的函數獨立記錄。因此，可見熒光染料的數量是發射光譜和擬合壽命的乘積。
圖03：lt-染料分離的原理證據（6個信號）。用480 nm激發云杉葉的新鮮切片，在兩個通道（頂部和底部行）中進行記錄，每個通道可分開顯示三個壽命（從左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。
徠卡顯微系統的FALCON（FAst Lifetime CONtrast）共聚焦和多光子顯微鏡匯集了所有這些新技術和新概念，生成FLIM技術，適用于多個應用領域。相較于傳統的TSCPS方法（時間相關單光子計數），圖像采集速度快了10倍，是迄今為止壽命成像的黃金標準。從而可以使用壽命對比來監測活體樣本的運動學和動力學情況。
其直接實現和自動化使研究人員不再需要耗時于硬件調整和數據評估。3D堆疊、延時序列、鑲嵌掃描和激發或發射波長掃描等復雜的數據采集模式與FLIM技術無縫結合。
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STELLARIS 8 FALCON FLIM熒光壽命成像顯微鏡
參考文獻：
1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)
2.F?rster T: Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physik. 437, p 55 (1948)
3.Becker W: Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. J. Microscopy 247/2, pp 119-136 (2012)
4.Borlinghaus RT, Birk H & Schreiber F: Detectors for Sensitive Detection: HyD. In: Mendez-Vilas A (ed.): Current microscopy contributions to advances in science and technology, Formatex Vol. 5, 818-825 (2012)
5.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12 pp 1176-1180 (2004)
6.Georgakoudi I et al: NAD(P)H and Collagen as in Vivo Quantitative Fluorescent Biomarkers of Epithelial Precancerous Changes. Cancer Research 62, 682– 687 (2002)
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