膜蛋白幾乎在所有生理過程中都起著重要作用，這些作用包括但不限于細胞間接觸、表面識別、酶活性或跨膜運輸等。膜蛋白作為生物膜功能的主要承擔者，其對于維持細胞乃至生物體的正常生理功能至關重要。據統計，約50%藥物的靶向分子為膜蛋白，特別是跨膜蛋白，它們占據了已知藥物靶點的很大比例。膜蛋白研究不僅有助于揭示疾病的發生機制，還能推動生物學研究的深入。此外，研究人員還可以設計出具有特定功能的膜蛋白或基于膜蛋白的生物材料。這些新材料在生物醫學、環境保護、能源開發等領域具有廣泛的應用前景。因此，膜蛋白的研究至關重要。
然而，目前膜蛋白研究依舊面臨著困境。首先在生物體內膜蛋白的表達量較低，其次，因膜蛋白自身具有高度疏水性，因此它在溶液中很容易形成聚集體，另外膜蛋白可能包含多個跨膜區域，糖基化修飾等等，且它在常規條件下難以維持正確的構象。
一
研究背景
傳統的基于細胞的膜蛋白表達通常會存在問題，比如：低產、細胞毒性、蛋白質聚集以及錯誤折疊等。而膜蛋白的結構和功能研究也因為難以生產足夠數量的蛋白質產品而受到嚴重阻礙。隨著生物技術的發展，無細胞蛋白質表達（CFPS）系統正被視為克服上述障礙的可行替代工具，因為在CFPS系統中幾乎不需要考慮細胞活力和蛋白表達過程，此外，該系統的開放性允許研究人員直接控制反應條件，例如，添加輔助試劑，各種形式的脂質、催化劑等等。
圖1:當前膜蛋白的CFPS策略
二
去垢劑存在下的CFPS
相比于傳統的基于細胞的表達系統來說，CFPS系統由于其與細胞活性解耦的特性，提供了一種更加快速高效的蛋白質合成方案。而去垢劑在此過程中起到了關鍵作用，通過溶解膜蛋白并防止其聚集，從而去提高膜蛋白的可溶性和表達效率。
已有研究討論了去垢劑對體外表達的膜蛋白的影響，那些在產量和溶解度方面都成功的實驗是使用臨界膠束濃度（CMC）相對較低的溫和去垢劑，而為了防止聚集體或不均勻的蛋白質聚合物的形成，表達的蛋白質和膠束之間的摩爾比不得高于1。通常是不建議使用具有相對高CMC的去垢劑，因為它們必須以相當高的濃度存在，因此會抑制轉錄和翻譯。
三
重組或直接插入囊泡和脂質體
體外膜蛋白重建的理想情況是在更類似于天然脂質雙分子層的環境中工作。將膜蛋白重新構建或直接插入到囊泡和脂質體中，是CFPS系統中一種重要的策略，這有助于研究膜蛋白的功能和結構。其中重新構建策略有兩種，包括從沉淀物中重新構建以及利用吸附劑顆粒。直接插入的策略也有兩種，包括在無細胞表達反應中直接加入脂質體（如DOPC、DMPC等）以及利用倒轉囊泡的方法。
通過重新構建或直接插入囊泡和脂質體的方法來實現更接近膜蛋白的天然環境，這將有助于保持膜蛋白的結構和功能，適用于功能研究和藥物傳遞等。然而脂質體和囊泡的異質性可能會影響結構生物學研究，且高質量的倒轉囊泡樣本難以制備，商業上也不易獲得。
四
使用納米脂蛋白顆粒（NLPs）
為了克服使用微粒體和囊泡的局限性，最近提出了基于使用“納米生物"或“納米脂蛋白顆粒"（NLP）的新策略。它是一種納米級的盤狀顆粒，由兩親性螺旋蛋白（即支架蛋白）包裹在脂質雙分子層的平面圓周上形成。NLPs的直徑取決于所使用的支架蛋白類型，通常在9～20納米之間，且分子質量偏差非常?。?lt;5%），這使得它們具有高度的單分散性。這種結構為膜蛋白的表達和研究提供了理想的平臺。
NLPs通過其的結構，能夠穩定地包裹和呈現膜蛋白，有助于保持其天然構象和功能。與微粒體和囊泡等傳統載體相比，NLPs具有更高的穩定性和可控性，從而顯著提高了膜蛋白的表達效率和純度。此外，NLPs還具有高度的可定制性，可以通過選擇不同的支架蛋白（如載脂蛋白A1、E和C，以及昆蟲的脂磷蛋白等）來適應不同類型的膜蛋白需求。
圖2:NLP存在下的無細胞蛋白質表達
五
未來展望
1. 結構生物學領域的挑戰與機遇
盡管CFPS技術在研究膜蛋白方面已經取得了顯著進展，部分膜蛋白結構已通過X射線晶體學和固態核磁共振（NMR）技術得到解析，但在結構生物學領域仍面臨重大挑戰。未來，需要更多地探索CFPS技術與結晶技術（如脂質立方相結晶）之間的協同效應，比如使用NLP（納米脂質顆粒）-蛋白質復合物而非去垢劑溶解的蛋白質來填充立方相基質，以期提高結構解析的成功率和質量。
2.多樣化表達策略
CFPS膜蛋白在產量、溶解度和蛋白質質量方面取得了顯著改進。未來，這一領域的研究將繼續聚焦于優化反應條件，以較大化膜蛋白的產量，并改善其溶解性和功能活性，從而推動下游應用的發展。無細胞表達膜蛋白的策略多種多樣，包括在去垢劑存在下的表達、作為沉淀表達、在脂質體或囊泡存在下的表達、使用NLPs的表達，以及與支架蛋白的共表達等等。每種策略都有其優勢和局限性。未來的研究將進一步開發和優化這些策略，以適應不同類型的膜蛋白和研究需求。
3.跨學科合作與技術創新
膜蛋白研究的復雜性要求跨學科的合作，包括生物化學、分子生物學、物理學和材料科學等領域。未來的研究將借助高通量篩選、機器學習等新技術，加速新方法的開發和應用，以提高無細胞表達膜蛋白的效率和成功率。
隨著無細胞表達膜蛋白技術的不斷成熟，其應用前景也將更加廣闊。在藥物研發、生物傳感器、生物能源、環境修復等領域，膜蛋白都展現出巨大的潛力。未來，將更多地探索這些潛在應用，推動相關技術的轉化和商業化。
參考文獻：
Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023;48(7):642-654. doi:10.1016/j.tibs.2023.03.006
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