Flash and Freeze
神經科學的一個基本問題是:突觸的結構和功能特性之間的關系是什么?在過去的幾十年里，電生理學已經闡明了突觸的傳導機制，而電子顯微鏡(EM)使人們對突觸的形態有了更深入的了解。將突觸生理學和超微結構聯系起來的方法可以追溯到20世紀中期，目的在于獲得突觸傳遞的圖像，即從電鏡拍攝的靜態圖片中捕捉動態過程。其中一種被稱為“閃光與凍結”（flash and freeze）的技術，結合了高壓冷凍（high-pressure freezing，HPF），對識別出的突觸前神經元的光發生刺激。
圖1 “閃光冷凍”示意圖
今天為大家介紹一種新穎的、可用于完整的哺乳動物急性腦切片和器官切片培養的快速和冷凍方法，該方法探索了小鼠海馬齒狀回顆粒細胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）的結構和功能，囊泡池的變化。
內容摘要神經科學的主要重點是進一步理解突觸的結構和功能，以及兩者之間的關系。盡管對突觸傳遞的認知有了重要進展，但仍有許多問題沒有得到解答。由于中樞突觸的分子組成、結構和功能高度多樣化，因此對突觸進行分析對逾越這些知識鴻溝大有裨益。
電鏡提供了具有納米級別的空間分辨率，然而它有一個很明顯的缺點就是只能捕捉靜態圖像。為了分析活標本中的突觸，通常使用共聚焦、雙光子和超高分辨技術成像，然而這些技術經常用于離體培養的神經元，很難達到足夠的分辨率來識別單個的激活區或單個突觸囊泡。因此，想要洞悉中樞突觸的結構-功能關系，需要尋找一項兼顧捕捉納米級空間和毫秒級時間分辨率的技術。
與以往報道方法不同的是，這種改進的“閃光與冷凍”技術，可應用于急性切片和類器官切片培養。這些優勢源于使用了薄的急性切片、改進后的載體幾何結構、恢復方案及低溫保護和冷凍技術。
基于這一依據，這一技術被應用于海馬齒狀回顆粒細胞（gyrus granule cell）與CA3錐體神經元之間的海馬苔蘚纖維突觸（hippocampal mossy fiber synapse）。苔蘚纖維突觸具有大突觸末端，形態超微結構明顯，突觸囊泡數量多，囊泡直徑變化大，存在致密的核囊泡。從生理學角度看，該突觸初始釋放概率低、突觸可塑性高。
實驗方法選擇用于研究突觸前神經元的轉基因小鼠，Prox1啟動子靶向這些樣本的齒狀回顆粒細胞。將pro1-creert2系與Ai32(ChR2(H134R)-EYFP)小鼠雜交，選擇性表達通道型視紫紅質。借助免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀測EYFP在顆粒細胞中的選擇性表達。急性切片制備與器官切片培養方式如前所述，使海馬苔蘚纖維保持好的狀態，以用于電生理學和高壓冷凍（HPF）實驗。
首先，對急性切片與器官切片培養中光刺激下的突觸傳導進行了深入的電生理學特征分析，以確定“閃光冷凍”實驗的參數，比如脈沖持續的時間和頻率。為了匹配
EM ICE高壓冷凍系統，需注意控制刺激的功率和強度。
圖2 優化后的“閃光冷凍”技術工作流
接下來，借助
EM ICE系統進行高壓冷凍和光刺激，使用EM AFS或EM AFS2進行冷凍替代。用杜氏樹脂對切片和器官培養物進行包埋，然后用
EM UC7冷凍超薄切片機制成超薄切片。
最后用透射電鏡(TEM)觀察樣品。根據苔蘚纖維的特性和形態差異，在海馬CA3區發現了苔蘚纖維末端。重點分析對照組和實驗組中活動區的著位囊泡的數量和直徑，以及在半活動區的潛在內吞凹陷形成。
實驗結果“閃光冷凍”電鏡的拍攝的HPF小鼠急性腦片海馬CA3區圖像如下：A)低倍鏡圖像顯示青苔狀纖維軸突(綠色箭頭)穿過透明層，CA3錐體神經元樹突(藍色箭頭)穿過青苔狀纖維，少量青苔狀纖維(紅色箭頭)位于這些樹突和軸突之間。B)高倍鏡圖像顯示苔蘚纖維(紅色箭頭)布滿突觸囊泡和苔蘚纖維軸突(綠色箭頭)。優化后的實驗體系保留了急性切片的超微結構，可媲美無光遺傳學刺激的HPF類器官腦片的超微結構。
圖3 HPF急性切片的EM圖像
結果顯示，“未釋放”囊泡池（the docked vesicle pool）和在和“已釋放”囊泡池（the functionally defined readily releasable pool）之間有重疊，即兩種囊泡具有共同的結構和功能部分，這為隨后突觸的快速內吞作用提供了證據。
此外，作者展示了中度刺激后內吞的孔狀結構外觀，提供了快速網格蛋白獨立的內吞機制的結構證據。
圖4 結果示意圖
實驗結論這項研究表明了了“閃光冷凍”技術的廣泛適用性，可用于小鼠海馬組織的急性切片和器官切片培養，也可用于包括小腦和腦干在內的多種大腦區域的急性切片。
總的來說，這一整體升級后的“EM”技術可用于急性大腦切片突觸傳遞過程中的多個時間節點的囊泡池變化（結構和功能）機制研究。
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References
- C. Borges-Merjane, O. Kim, P. Jonas, Functional Electron Microscopy, ‘‘Flash and Freeze,’’ of Identified Cortical Synapses in Acute Brain Slices, Neuron (2020) vol. 105, iss. 6, pp. 992–1006, DOI: 10.1016/j.neuron.2019.12.022.
- D. Vandael, C. Borges-Merjane, X. Zhang, P. Jonas, Short-term plasticity at hippocampal mossy fiber synapses is induced by natural activity patterns and associated with vesicle pool engram formation, Neuron (2020) vol. 107, iss. 3, pp. 509-521, DOI: 10.1016/j.neuron.2020.05.013.
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