培安有限公司
【CEM 多肽合成儀】CarboMAX™ – 在提高的溫度下增強(qiáng)的肽偶聯(lián)
檢測樣品：肽 磷酸肽 糖肽
檢測項(xiàng)目：多肽合成
方案概述：CarboMAX是一種創(chuàng)新的專利偶聯(lián)技術(shù)，專為高溫下的肽鏈合成而設(shè)計(jì)。該技術(shù)相較于現(xiàn)行的碳二亞胺方法，提供了更快的反應(yīng)激活速度，和減少相應(yīng)的外消旋化，從而顯著提升了合成效率。此外，CarboMAX在高溫條件下增強(qiáng)了對(duì)酸敏感連接物的穩(wěn)定性，特別對(duì)于磷酸肽、糖肽的合成，以及在超酸敏感鏈接劑上進(jìn)行肽鏈合成時(shí)，這一特性尤其有利。
CarboMAX 是一種創(chuàng)新的專禾刂偶聯(lián)技術(shù)，專為高溫下的肽鏈合成而設(shè)計(jì)。該技術(shù)相較于現(xiàn)行的碳二亞胺方法，提供了更快的反應(yīng)激活速度，和減少相應(yīng)的外消旋化，從而顯著提升了合成效率。此外，CarboMAX 在高溫條件下增強(qiáng)了對(duì)酸敏感連接物的穩(wěn)定性，特別對(duì)于磷酸肽、糖肽的合成，以及在超酸敏感鏈接劑上進(jìn)行肽鏈合成時(shí)，這一特性尤其有利。
02 引言 Introduction
近期研究表明，在 90°C 的條件下，利用高效固相肽合成過程（HE-SPPS）進(jìn)行的原位碳二亞胺激活可以實(shí)現(xiàn)快速且高效的肽偶聯(lián)。HE-SPPS 避免了使用基于季銨鹽的方法（例如 HCTU 和 HATU）時(shí)所需的大量強(qiáng)堿，從而減少了顯著的外消旋化問題（特別是對(duì)于半胱氨酸），以及由于d-內(nèi)酰胺形成而導(dǎo)致的精氨酸缺失。CarboMAX 偶聯(lián)方法通過對(duì)現(xiàn)有碳二亞胺方法的兩個(gè)主要改進(jìn)，進(jìn)一步提升了合成效果：
(i) 提升粗制品純度與減少外消旋化：
CarboMAX 通過提高相對(duì)于氨基酸的碳二亞胺用量（2當(dāng)量），加速了必要的O-酰基異脲激活中間體的形成，這一過程在碳二亞胺激活中通常較為緩慢。O-酰基異脲形成的速率增加，使得偶聯(lián)步驟早期即可獲得更多的激活氨基酸。因此，實(shí)現(xiàn)了更快的偶聯(lián)速度，并相應(yīng)地降低了外消旋化的發(fā)生。在眾多實(shí)例中，CarboMAX 的應(yīng)用顯著提升了粗制品的純度。
(ii) 避免酸敏感官能團(tuán)/接頭的非期望裂解：
與碳二亞胺化學(xué)反應(yīng)配合使用的激活劑（如Oxyma Pure）具有酸性，可能在高溫下過早地移除酸敏感基團(tuán)。CarboMAX 方法通過使用少量的堿（相對(duì)于激活氨基酸 0.4 當(dāng)量的 DIEA）來穩(wěn)定這些酸敏感連接體。這些堿的用量足夠低，不會(huì)干擾激活過程，同時(shí)保持外消旋化降至蕞低。
03 材料與方法 Materials and Methods
試劑
所有標(biāo)準(zhǔn)的 Fmoc 氨基酸均購自 CEM 公司（位于北卡羅來納州的馬修斯），包含以下側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)：Arg(Pbf)，Asn(Trt)，Asp(OMpe)，Cys(Trt)，Gln(Trt)，Glu(OtBu)，His(Trt)，Lys(Boc)，Ser(tBu)，Thr(tBu)，Trp(Boc)和Tyr(tBu)。磷酸化氨基酸 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH和Fmoc-Thr(PO(OBzl)OH)-OH，Oxyma Pure 以及 Rink Amide ProTideTM LL 樹脂也購自 CEM 公司（位于北卡羅來納州的馬修斯）。Fmoc-Thr(β-D-GlcNAc(Ac)3)-OH和Fmoc-Lys(palmitoyl-Glu-OtBu)-OH 購自 Bachem（瑞士）。N,N-二異丙基碳二亞胺（DIC），N,N-二異丙基乙胺（DIEA），哌啶，三氟乙酉夋（TFA），3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT），三異丙基硅烷（TIS）和乙酸購自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。二氯甲烷（DCM），N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和無水乙酉迷（Et2O）購自VWR（賓夕法尼亞州西切斯特）。HPLC級(jí)水（H2O）和HPLC級(jí)乙腈（MeCN）購自Fisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。
肽合成
肽的制備采用 0.05 或 0.1 毫摩爾規(guī)模，使用 CEM Liberty Blue™ 自動(dòng)化微波肽合成儀，在 0.18 毫摩爾/克的 Rink Amide ProTide LL 樹脂（CEM零件號(hào)R002）上進(jìn)行，除非另有說明。去保護(hù)反應(yīng)使用含有20% 哌啶的 DMF 進(jìn)行。偶聯(lián)反應(yīng)使用 5 當(dāng)量的氨基酸，以 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma Pure 在 DMF 中進(jìn)行。切割步驟使用 CEM Razor 高通量肽切割系統(tǒng)，在升高的溫度下用 TFA/H2O/TIS/DODT 進(jìn)行 30 分鐘。切割后，肽在冷乙酉迷中沉淀并過夜凍干。
肽分析
肽的分析在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)裝配了 Acquity UPLC BEH C8 柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統(tǒng)連接到 Waters 3100 Single Quad MS 以進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。峰分析通過 Waters MassLynx 軟件實(shí)現(xiàn)。分離采用含有0.05% TFA 的 (i) H2O 和 (ii) MeCN 的梯度洗脫進(jìn)行。
04 結(jié)果 Results
通過采用 CarboMAX 策略（即相對(duì)于氨基酸使用 2 當(dāng)量的 DIC），相較于傳統(tǒng)的 1 當(dāng)量使用，顯著提升了肽的純度。
這一改進(jìn)在 8 種矢口名肽的合成過程中得到了驗(yàn)證，這些肽分別采用了標(biāo)準(zhǔn)碳二亞胺化學(xué)方法和 CarboMAX 策略進(jìn)行合成（見表1；圖1至6）。關(guān)鍵的是，在使用過量碳二亞胺的過程中，并未發(fā)現(xiàn)不良封端現(xiàn)象。
表1. 通過應(yīng)用 CarboMAX 偶聯(lián)方法改善了肽的純度
肽 | 粗純度 （標(biāo)準(zhǔn)） | 粗純度 （CarboMAX） |
Thymosin | 63% | 75% |
GRP | 62% | 74% |
Bivalirudin | 80% | 82% |
1-34PTH | 67% | 85% |
35-55MOG | 77% | 91% |
Magainin 1 | 71% | 79% |
Dynorphin A | 74% | 82% |
Liraglutide* | 74% | 88% |
*用~0.32 mmol/g Fmoc-Gly-Wang PS樹脂合成
通過優(yōu)化O-酰基異脲的形成過程，CarboMAX 技術(shù)能夠迅速供應(yīng)更高濃度的活性氨基酸。這一優(yōu)勢(shì)對(duì)于縮短敏感酯類物質(zhì)在后續(xù)酰化反應(yīng)前的存活時(shí)間至關(guān)重要。為了證實(shí)此效果，研究人員采用了水解、繼之衍生化以及氣相色譜（由 C.A.T. GmbH 執(zhí)行）等手段，對(duì) Liraglutide 序列中各氨基酸的差向異構(gòu)水平進(jìn)行了深入分析。表 2 的數(shù)據(jù)明顯顯示，在使用 CarboMAX 的過程中觀察到的差向異構(gòu)現(xiàn)象有減少的趨勢(shì)，從而佐證了加速O-酰基異脲生成的理論。因此，相較于以往描述的任何高溫偶聯(lián)方法，CarboMAX 偶聯(lián)技術(shù)憑借其提升的偶聯(lián)效率和降低的差向異構(gòu)率，實(shí)現(xiàn)了更佳的粗制品純度。
表2. 利拉魯肽的差向異構(gòu)化水平
%-D 差向異構(gòu)體 | 2 分鐘 90 °C 標(biāo)準(zhǔn) | 2 min-90 °C CarboMAX |
D-Ala | 0.33 | 0.25 |
D-Arg | 0.29 | 0.20 |
D-Asp | 0.23 | 0.31 |
D-Glu | 0.39 | 0.30 |
D-Ile L-allo Ile D-allo Ile | <0.10 <0.10 <0.10 | <0.10 <0.10 <0.10 |
D-Leu | 0.17 | 0.13 |
D-Lys | <0.10 | 0.10 |
D-Phe | 0.20 | 0.16 |
D-Ser | 0.16 | 0.12 |
D-Thr L-allo Thr D-allo Thr | <0.10 <0.10 <0.10 | <0.10 <0.10 <0.10 |
D-Trp | 0.24 | <0.10 |
D-Tyr | 0.12 | 0.11 |
D-Tyr | <0.10 | <0.10 |
CarboMAX 策略的一個(gè)可選優(yōu)化是在氨基酸反應(yīng)中采用 0.4 當(dāng)量的堿。這一調(diào)整確保了在整個(gè)激活和偶聯(lián)過程中，DIEA（N,N-二異丙基乙胺）以催化量存在，有效地穩(wěn)固了酸敏感鍵合（詳見表 3）。該優(yōu)化最初通過應(yīng)用超酸敏感樹脂鏈接劑進(jìn)行了驗(yàn)證。在肽合成領(lǐng)域，運(yùn)用諸如2-Cl-三苯甲基、三苯甲基（Trt）以及 Cl-TCP 這類超酸敏感鏈接劑至關(guān)重要，它們促進(jìn)了受保護(hù)的肽段的縮合，防止了二酮哌口秦生成，規(guī)避了在樹脂裝載時(shí)的DMAP使用，并顯著減少了 C 端半胱氨酸殘基發(fā)生β消去的風(fēng)險(xiǎn)。
在 90°C 條件下，采用 DIC/Oxyma Pure 進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)碳二亞胺偶聯(lián)反應(yīng)僅進(jìn)行了 2 分鐘，這導(dǎo)致了在三苯甲基樹脂連接劑上合成 ACP 肽的產(chǎn)率不盡人意。不過，當(dāng)反應(yīng)中加入了 0.1 當(dāng)量的 DIEA 并在同樣的高溫下實(shí)施 CarboMAX 偶聯(lián)策略時(shí)，不僅保護(hù)了三苯甲基連接劑的鍵穩(wěn)定性，還成功地將產(chǎn)率顯著提升，從原先的 38% 躍升至 96%。這一顯著的提升彰顯了 CarboMAX 偶聯(lián)方法在提高肽合成效率方面的*性。
表3. 使用高酸敏感型 Fmoc-Gly-NovaSyn TGT 樹脂合成ACP
偶聯(lián)溫度（°C） | 偶聯(lián)時(shí)間（min） | 激活 | DIEA（當(dāng)量） | 粗品純度（%） | 粗品收率（%） |
90 | 2 | DIC/Oxyma Pure | 0 | 90 | 38 |
90 | 2 | DIC/Oxyma Pure | 0.1 | 95 | 38 |
65-74ACP: VQAAIDYING
在高溫條件下，涉及磷酸氨基酸衍生物的合成反應(yīng)面臨著由β-消除引起的磷酰基團(tuán)丟失的風(fēng)險(xiǎn)，這種風(fēng)險(xiǎn)在去保護(hù)和酸性切割過程中尤為顯著。此外，一旦磷酸氨基酸被引入到序列中，它所產(chǎn)生的顯著空間位阻會(huì)使得后續(xù)殘基的偶聯(lián)變得異常困難。采用 CarboMAX 偶聯(lián)方法并配合 0.4 當(dāng)量的 DIEA，研究成功合成了以 3 個(gè)磷酸氨基酸殘基為主的目標(biāo)磷酸肽，如圖 7a 所展示的成果。與此形成鮮明對(duì)比的是，未添加 DIEA 的合成實(shí)驗(yàn)未能檢測到目標(biāo)肽的存在（圖 7b）。
TpTGNGKPVECpSQPESSFKMpSFKR
圖7a. 使用 UPLC-MS 分析粗磷酸肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）
圖7b. 粗磷酸肽的 UPLC-MS 分析（標(biāo)準(zhǔn)品）
此外，O-連接的糖基氨基酸含有可能在高溫碳二亞胺偶聯(lián)過程中斷裂的敏感鍵。通過采用 CarboMAX 偶聯(lián)技術(shù)并添加 0.4 當(dāng)量的 DIEA，實(shí)現(xiàn)了 MUC-1 糖肽的合成，粗品純度高達(dá) 72%，如圖 8 所示。值得一提的是，CarboMAX 方法僅需要使用 2 當(dāng)量的糖基氨基酸過量，這在考慮到糖基化氨基酸昂貴成本的情況下，顯著降低了材料費(fèi)用，經(jīng)濟(jì)效益顯著。
PAHGVT[β-D-GlcNAc(Ac)3]SAPDTRPAPGSTAP
圖8. 使用 UPLC-MS 分析粗 MUC-1 糖肽 0.4 等效 DIEA （CarboMAX）
05 結(jié)論 Conclusion
CarboMAX 方法通過微波輔助的固相肽合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)了更快的偶聯(lián)反應(yīng)和較低的差向異構(gòu)化。對(duì)于昂貴或難以合成的氨基酸殘基，僅需使用 2 當(dāng)量即可有效進(jìn)行偶聯(lián)。此外，可選地加入催化量的 DIEA（0.4 當(dāng)量），有助于在高溫條件下預(yù)防酸敏感鍵的不必要斷裂，從而保護(hù)了肽鏈的完整性。
引用 References
(1) J. Collins, K. Porter, S. Singh and G. Vanier, “High-Efficiency Solid Phase Peptide Synthesis (HE-SPPS),” Org. Lett., vol. 16, pp. 940-943, 2014.
(2) Patent Pending: US15686719; EP17188963.7
(3) Patent Pending: US20160176918; EP3037430;JP2016138090; CN105713066; AU2017204172
相關(guān)產(chǎn)品清單
溫馨提示：
1.本網(wǎng)展示的解決方案僅供學(xué)習(xí)、研究之用，版權(quán)歸屬此方案的提供者，未經(jīng)授權(quán)，不得轉(zhuǎn)載、發(fā)行、匯編或網(wǎng)絡(luò)傳播等。
2.如您有上述相關(guān)需求，請(qǐng)務(wù)必先獲得方案提供者的授權(quán)。
3.此解決方案為企業(yè)發(fā)布，信息內(nèi)容的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和合法性由上傳企業(yè)負(fù)責(zé)，化工儀器網(wǎng)對(duì)此不承擔(dān)任何保證責(zé)任。
最新解決方案
- IPHASE/匯智和源 推出快速平衡透析裝置助力血漿蛋白結(jié)合率研究
- 【ISCO】RediSep® 反相 C18、C18Aq 和C8色譜柱使用、清潔及存儲(chǔ)指南
- Ultimate XB-C18測定益腎養(yǎng)元顆粒中橙皮苷含量
- Ultimate Plus C18測定清肺化痰丸中黃芩苷含量
- 【ISCO】反相RediSep®柱在肽分離中的應(yīng)用與優(yōu)化
- 前瞻2025版中國藥典 | 譜育科技中藥元素形態(tài)和價(jià)態(tài)分析解決方案
- 上新！IPHASE原代肝細(xì)胞分離試劑盒，助您分出“心目中的它”！
- 【HANSON】阿昔洛韋霜5%（Zovirax, US）的體外滲透研究（IVPT）
- Xtimate C18測定鹽酸氨溴索注射液有關(guān)物質(zhì)
- Ultimate HILIC Amide 測定抗壞血酸鈉含量
該企業(yè)的其他方案
- 【ISCO】RediSep® 反相 C18、C18Aq 和C8色譜柱使用、清潔及存儲(chǔ)指南
- 【ISCO】反相RediSep®柱在肽分離中的應(yīng)用與優(yōu)化
- 【CEM】從黃瓜、番茄和青椒中提取農(nóng)藥
- 【HANSON】阿昔洛韋霜5%（Zovirax, US）的體外滲透研究（IVPT）
- 【CEM】微波輔助的肽棕櫚酰化：提高合成效率的新策略
- 【CEM】大型混合食品樣品的微波消解：不同重量樣品的處理
- 【eralytics】混合溶劑對(duì)煙用香精閃點(diǎn)的影響
- 【CEM】ORACLE vs. 傳統(tǒng)脂肪測定方法
- 使用RDS Phoenix自動(dòng)化擴(kuò)散站進(jìn)行IVRT方法測定Eucrisa局部用軟膏的釋放速率
- 【ISCO】黃原膠與HPAM溶液在貝雷砂巖中的流變學(xué)比較
業(yè)界頭條
- 2024年前三季度中藥上市公司業(yè)績下降，主要受這三個(gè)因素影響
-
根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2024年前三季度業(yè)績報(bào)告中，72家中藥類上市公司(不含港股)中，營業(yè)收入同比下滑的中...
