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摘 要

使用具有 CarboMAX™ 偶聯方法的 Liberty Blue™ 自動微波肽合成儀能進行難以合成的磷酸肽的高效合成。微波能量的使用被證明對于偶聯龐大的磷酸氨基酸衍生物非常有效，而使用CarboMAX 偶聯方法可以在高溫下保護酸不穩定的受保護磷酸基團，從而大限度地減少副反應。使用這種方法，在不到 2 小時內分別組裝了以下磷酸肽：CTEDQY(pS)，LVED-NH₂（82% 純度）、CPSPA(pT)DPSLY-NH₂（73%純度）和CSDGG(pY)MDMSK-NH₂（62% 純度）。

簡 介

磷酸化是一種翻譯后修飾 (PTM)，它涉及將磷酸基團引入肽或蛋白質的蘇氨酸、絲氨酸或酪氨酸殘基上¹。酶促磷酸化調節許多蛋白質的功能并引導許多細胞內信號轉導級聯²。由于磷酸化在生物學中的不可或缶夬的作用，近年來對磷酸化肽合成的興趣穩步增長，特別是隨著細胞生物學家和蛋白質組學研究人員尋求更好地理解和表征磷酸化蛋白質組³。初，磷酸化肽的生產需要合成整個肽，然后是合成后的磷酸化步驟。這種合成后方法通常難以實施，而且經常產生不純的肽⁴。引入 Fmoc 衍生的單芐基保護的磷酸氨基酸，例如 FmocThr(PO(OBzl)OH)-OH、Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH 和 FmocTyr(PO(OBzl)OH-OH（圖1）顯著改進了合成過程，并成功實現了 SPPS 的自動化，適用于各種磷酸肽。⁵

圖1. Fmoc 衍生的單芐基保護的磷酸氨基酸

微波能已被用于合成磷酸肽。先前已證明偶聯磷酸氨基酸后的第一次脫保護應在室溫下進行，以防止受保護的磷酸基團的β-消除。此外磷酸鍵對酸不穩定，因此在碳二亞胺偶聯過程中易于在高溫下去除。使用 0.4 當量 DIEA 的 CarboMAX 方法對于穩定酸敏感鍵（包括受保護的磷酸基團）非常有效。CarboMAX 近被證明可以成功合成含有 3 個受保護的磷酸基團的磷酸肽。微波偶聯步驟已被證明可以改善磷酸化殘基的直接和后續偶聯，并大限度地減少去磷酸化和缺失產物 (CarboMAX)⁶。

材 料 和 方 法

試 劑

所有氨基酸均獲自 CEM Corporation (Matthews, NC) ，并含有以下側鏈保護基團：Asn (Trt)、Asp (OMpe)、Cys (Trt)、Gln (Trt)、Glu (OtBu)、Lys( Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)。Fmoc 單芐基保護的磷酸氨基酸也得自 CEM Corporation (Matthews, NC)：N-α-Fmoc-O-芐基-L-磷酸絲氨酸 (pS)、N-α- Fmoc-O-芐基-L-磷酸酪氨酸 (pY)、和 N-α-Fmoc-O-芐基-L-磷酸蘇氨酸 (pT)。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTide™ LL 樹脂購自CEM Corporation (Matthews, NC) 。N,N'-二異丙基碳二亞胺 (DIC) 購自 CreoSalus (Louisville, KY)。哌啶獲自Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。三氟乙酉夋 (TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三異丙基硅烷 (TIS)、N,N-二異丙基乙胺 (DIEA) 茴香硫醚和乙酸購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO）。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和無水乙酉迷 (Et₂O) 購自 VWR (West Chester, PA) 。LCMS 級水 (H₂O) 和 LCMS 級乙腈(MeCN) 購自 Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多 肽 合 成

使 用 CEM Liberty Blue 自 動 微 波 肽 合 成 儀 在 Rink Amide ProTide LL 樹脂（0.20 meq/g  取代）上以 0.1 mmol 規模制備肽。用哌啶和 Oxyma Pure 在 DMF 中進行脫保護。偶聯反應使 用 5 倍 過 量 的 Fmoc-AA-OH、DMF 中 的 DIC 和 DMF (CarboMAX) 中的 Oxyma Pure/DIEA 進行。⁶在 CEM Razor™ 上使用 TFA/茴香硫醚/TIS/H₂O/DODT 進行裂解平行肽切割系統。裂解后，肽在無水乙酉迷中沉淀并凍干過夜。

結 果

在 Liberty Blue 自動微波肽合成儀上 CTEDQY(pS)LVED-NH₂ 的微波增強 SPPS 產生了純度為 82% 的目標肽（圖2）。沒有觀察到 Tyr 缺失。CPSPA(pT)DPSL Y-NH₂ 的微波增強 SPPS 產生了73% 純度的目標肽（圖3）。觀察到少量7-11位氨基酸的截斷。CSDGG(pY) MDMSK-NH₂ 的微波增強 SPPS 產生了 62% 純度的目標肽（圖4）。觀察到小的天冬酰胺形成和甲硫氨酸氧化。

圖2. CTEDQY(pS)LVED-NH2的UPLC色譜

圖3. CPSPA(pT)DPSLY-NH2的UPLC色譜

圖4. CSDGG(pY)MDMSK-NH2的UPLC色譜

結 論

Liberty Blue 自動微波肽合成儀上的微波增強型 SPPS 可快速高效地生產高質量的磷酸肽，例如 CTEDQY(pS)LVEDNH₂、CPSPA(pT)DPSLY-NH₂ 和 CSDGG(pY)MDMSK-NH₂。插入磷酸絲氨酸后的室溫去保護大限度地減少了CTEDQY(pS)LVED-NH₂ 合成中的去磷酸化。使用 Fmoc-Asp(OMpe)-OH 可大限度地減少敏感序列中天冬酰胺形成的發生，尤其是 CSDGG(pY)MDMSK-NH₂。微波增強的 SPPS 可以改善磷酸化殘基的直接和后續偶聯，同時大限度地減少不必要的副反應。

參考文獻

(1) Prabakaran, S.; Lippens, G.; Steen, H.; Gunawardena, J. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2012, 4 (6), 565–583.

(2) Chen, J.; Shinde, S.; Koch, M.-H.; Eisenacher, M.; Galozzi, S.; Lerari, T.; Barkovits, K.; Subedi, P.; Krüger, R.; Kuhlmann, K.; Sellergren, B.; Helling, S.; Marcus, K. Sci. Rep. 2015, 5 (1), 11438.

(3) Dephoure, N.; Gould, K. L.; Gygi, S. P.; Kellogg, D. R. Mol. Biol. Cell 2013, 24 (5), 535–542.

(4) White, P. D. In Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Chan, W. C., White, P. D., Eds.; Oxford University Press: New York, 2000; pp 187–189.

(5) Perich, J. W.; Ede, N. J.; Eagle, S.; Bray, A. M. Lett. Pept. Sci. 1999, 6 (2/3), 91–97.

(6) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”

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