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疫苗專題：乳佐劑制備與理化結構特性

隨著亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、抗*性抗體疫苗等各種新型疫苗的出現，免疫佐劑的研究越來越被人們關注，臨床應用也越來越廣泛。這些新型疫苗雖然具有抗原性良好、毒性低等優點，但因其免疫原性低，需要配合高效免疫佐劑的使用。免疫佐劑可以先于抗原或與抗原同時使用，能夠非特異地增強機體對抗原的特異性免疫應答反應，而自己本身并無抗原性。對于很多傳染病，因缺乏合適的佐劑而影響重組蛋白、多肽、菌苗、DNA疫苗、毒苗等的發展。因此，對于傳染病的防控不僅是研發高效低毒的疫苗，免疫佐劑的研發也至關重要。

乳佐劑簡述

油乳型佐劑是指將一定比例的油相和水相物料通過乳化，制備成油包水（W/O）或水包油（O/W）形式的乳劑。油乳型佐劑具有促進多種抗原產生高效價的抗體、使抗原連續刺激的時間相對延長、抗原接種的劑量減少、抗原接種的次數降低的優點。目前市場上常見的油乳佐劑主要有弗氏佐劑、白油 Span 佐劑、MF-59、ISA 206、ISA720、佐劑－65、SAF 等，其中人用疫苗多用水包油佐劑。

研究表明，粒徑是影響納米粒在體內運輸和被抗原遞呈細胞吞噬的重要因素。從細胞吞噬的角度來看，小于1μm的納米粒子更容易被DC和巨噬細胞吞噬，粒徑小于1μm適合引發系統免疫。從粒子傳輸的角度來看，小粒徑的納米粒(<100nm)更易通過淋巴管進行傳輸從而提高免疫效果，但是粒徑過小納米粒會滲入到血管中，過大又會影響其在淋巴管中的傳輸速度。因此粒徑在20-50nm范圍內的納米粒是疫苗佐劑的佳粒徑范圍。但與此同時，目前上市和處于臨床研究階段的相應納米級乳劑佐劑(如MF59、AS01-04系列、NB001-002系列等)，其粒徑均大于160nm，使得納米級(1-100nm) 藥用制劑所具有的顆粒尺小、比表面積大、表面能高、表面效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應等優勢無法充分發揮，同時上述佐劑亦不具有類似鋁鹽佐劑的良好蛋白抗原吸附能力，在一定程度上使疫苗的免疫保護效力及免疫持久性受到了限制。

納米免疫佐劑中的納米乳免疫佐劑，是一個由油、水、表面活性劑和助表面活性劑四部分組成、粒徑為1~100nm、液滴多為球形，大小均勻，透明或半透明、具有熱力學穩定性和各向同性、熱壓滅菌或高速離心穩定不分層、制備的條件溫和、可自發形成的膠體分散系統。

納米乳佐劑對疫苗具有以下顯著優勢：

(1)可抵抗體液的稀釋和蛋白酶降解，從而保護抗原，增強藥物吸收、提高抗原的生物利用率。

(2)促進疫苗的抗原攝取和遞呈，提高藥效。

(3)促進機體的免疫系統作用。

(4)提高藥物的穩定性。

(5)工藝簡單，易于制備與運輸、容易保存。

因此，研制出粒徑20-50nm范圍、具有高度熱力學穩定、且能刺激機體產生高強度的粘膜免疫應答納米乳免疫佐劑對疫苗顯得尤為重要。

制備方案

均質機的選擇

微射流均質屬于高壓均質中的一種，在生物工程、輕工化工、食品飲料等領域均有廣泛的應用。微射流均質的方法在作用過程中產生的一系列高強度破壞力（湍流力、剪切力以及空穴效應）能有效破碎較大顆粒的液滴，進而形成較小顆粒的納米乳液，且均質條件、表面活性劑組分和濃度的變化都影響乳液粒徑。Roberts等研究發現微射流均質機所具有空腔效應可以改變表面活性劑的結構，降低乳液的粒徑大小，進而提高體系的穩定性，并適用于各類乳液。

由PSI專有技術研發的增壓器及均質腔，通過調節恒定的均質壓力并搭配優秀的Y、Z型幾何結構微米級金剛石均質腔，能夠獲得穩定可控的剪切力，從而對工藝流程的穩定以及線性放大的保證起到可靠支持。高2069 bar的均質壓力搭配低于100μm孔徑的均質腔，其產出的高剪切力超過市面上絕大多數同類型儀器。低至15mL的死體積更利于用作實驗研發、處理珍貴稀有樣品。有助于研發、生產過程中優化配方以獲得大的穩定性，延長貨架期、降低生產成本。

PSI包括PSI-20、PSI-40、PSI-300等從小試到生產多種型號，可滿足不同科研或生產需求。

理化表征：粒徑和Zeta電位

CDE發布《病毒預防用疫苗研發技術指導原則（試行）》中指出“如涉及佐劑或新型抗原遞呈系統，應結合其與抗原相互作用的結構或特性開展必要的質量研究，理化結構特性如佐劑等電點、粒徑及其分布、與抗原的吸附率等；脂質體包封率、粒徑等。”

（1）平均粒徑和尾端大粒子：

粒徑分布檢測經典的表征手段，通過粒徑分布可以直觀分析出均質機制備后的差異。從而反推配方或工藝，指引研發。或者通過粒徑檢測來確認批間差，鑒定設備運行狀況。

Nicomp Z3000采用DLS和PALS原理，通過對粒徑分布（高斯分布和Nicomp多峰），PI值，Chi卡方值等作為質量控制指標。

穩定性研究一直是制劑里面重要的一項，引起不穩定的因素有很多，異常顆粒或者說尾端大顆粒往往受到忽視，雖然乳佐常規平均粒徑一般在亞微米級別或者納米級別，但是微米的乳粒往往大量存在，而這些尾端大顆粒的存在往往會吸附小顆粒，不斷團聚成大顆粒，導致穩定性差，甚至出現破乳、油相分離等現象，影響產品質量。

AccuSizer A7000APS采用SPOS技術，可以實現針對500nm以上高濃度樣品進行計數檢測。通過對尾端大顆粒定量分析，輕松幫助客戶找到之前一直困擾客戶的質量問題。

（2）Zeta電位：

Zeta電位的檢測往往通過納米粒度儀進行檢測，Zeta電位作為穩定性的一項參考指標。Zeta 電位是通過檢測粒子與液體接觸的擴散層電荷從而反映的是整個體系的穩定程度，一般受到PH值，溫度，特殊添加劑（如表面活性劑）等因素影響，一般認為當絕對值大于30mv，體系較為穩定。

Nicomp Z3000采用ELS技術，通過頻譜分析和PALS分析進行Zeta電位檢測。無論是針對水相還是有機相樣品，都可以輕松完成檢測，更進一步通過Zeta電位正負值判定表面修飾，或通過pH調節來確定等電點IEP。

圖四 某樣品Zeta電位檢測報告

總結

奧法美嘉通過PSI微射流均質機和PSS粒度儀的Nicomp Z3000、AccuSizer A7000APS提供從初乳均質到粒徑分析的全套方案，為制藥企業從研發到生產保駕護航。

• 意大利PSI-40高壓微射流均質機

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