表觀修飾不需要改變DNA序列便能實現(xiàn)對性狀的改變，表觀修飾的改變與基因功能乃至細胞狀態(tài)、發(fā)育、衰老、疾病等存在重要的關(guān)聯(lián)。在眾多的表觀遺傳修飾中，*為重要且研究*為廣泛的修飾是DNA甲基化。

由于PCR的擴增過程會消除堿基修飾信息，通過傳統(tǒng)測序技術(shù)對其進行檢測需要使用特殊的文庫制備步驟，從而造成核酸損壞，*終導(dǎo)致測序讀長序列非常短。

Nanopore測序是Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司開發(fā)的基于納米孔電信號的單分子實時測序技術(shù)，DNA雙鏈在馬達蛋白的作用下與錨定在生物膜上的八聚體納米孔蛋白結(jié)合并解螺旋。由于生物膜兩測存在電勢差，解旋后的單鏈DNA以一定速率通過納米孔。由于化學(xué)性質(zhì)不同，不同堿基通過納米孔時，會引起不同電信號的變化。通過對這些電信號變化進行檢測和解析，完成序列的實時測定。Nanopore的堿基判讀是依據(jù)其電流信號而產(chǎn)生，因此其判定過程比較復(fù)雜。目前Nanopore根據(jù)電流的大小及電流大小的變化情況，通過“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network）”的復(fù)雜算法對堿基進行判讀。

ONT全基因組甲基化測序原理示意圖如右圖：

技術(shù)優(yōu)勢：

1、長讀長：平均讀長＞10Kbp，*長可達2M左右，直接跨越重復(fù)序列、高度多態(tài)性區(qū)域等特殊區(qū)域；

2、直接測序：無需PCR擴增，可直接保留并檢測DNA甲基化修飾；

3、性價比高：ONT測序成本相對于二代NGS測序技術(shù)大幅降低；

4、全基因組覆蓋：可同時檢測全基因組范圍單堿基的5mC與6mA修飾位點，并給出單堿基的甲基化水平。

實驗策略：

分析內(nèi)容：

技術(shù)參數(shù)：

經(jīng)典案例：

通過表觀遺傳印跡研究痤瘡桿菌(C.acnes)噬菌體的選擇

Engineering ｓelectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting

1、背景：

痤瘡桿菌（C.acnes）是一種革蘭氏陽性細菌，是人類皮膚微生物組成員。盡管是*豐富的皮膚共生體，但某些成員與常見的炎癥性疾病（如痤瘡）有關(guān)。各種C.acnes分支的完整基因組序列可以鑒定推定的甲基轉(zhuǎn)移酶，其中一些可能屬于保護入侵DNA宿主的限制性修飾（R-M）系統(tǒng)。然而，關(guān)于這些系統(tǒng)是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。

2、方法：

通過Oxford Nanopore Technologies（ONT）測序分析了六種代表性痤瘡C.acnes菌株的甲基化水平。

3、結(jié)論：

在菌株KPA171202中確定的DNA共有序列上檢測到6mA修飾，且該R-M系統(tǒng)的重組表達證實了其甲基化活性，而R-M敲除突變體驗證了該菌株甲基化特性的缺失。此外還研究了C. acnes噬菌體（PAD20）殺死各種C. acnes菌株的潛力，并將其特異性的增加與甲基化敏感株獲得的噬菌體DNA甲基化聯(lián)系起來。研究證明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌體選擇性地殺死R-M缺失痤瘡敏感分支，而益生菌保持對噬菌體感染的抗性。

ONT測序揭示C. acnes KPA171202的R-M系統(tǒng)IIIB影響PAD20噬菌體感染特性并保護細菌免于裂解。

參考文獻：

① Kn?dlseder N, et al. Engineering ｓelectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):

e1010420.

② Gouil Q, Keniry A. Latest techniques to study DNA methylation. Essays Biochem. 2019 Dec 20;63(6):639-648.