豚鼠豐富重復蛋白(PRELP) ELISA 試劑盒

獲得idea的兩種途徑：

1. 自上而下：先閱讀大量科研論文，弄清目前的研究現狀和要解決的問題等；

2. 自下而上：自己先冥思苦想一段時間，有了自己的idea后再去查文獻。

但值得注意的是，別人沒做過的東西，也許不是因為別人沒想到，很可能是因為沒有意義或者沒有可能性。

獲得好idea的基礎前提包括：

首先在科研前必須彌補基礎知識，這是看懂文獻的基礎；其次廣泛閱讀文獻；然后學會閱讀文獻，讀懂文章。

拿到一篇研究性論文，先看標題，立即停住，問自己幾個問題：

（1）這文章是怎么做的（可參考材料方法）？會做哪些內容來說明其標題？

（2）為什么要做這個？

（3）如文章是近半年內發表的，該文章解決了什么問題？引出了什么問題（結合你看的綜述）？接下來仔細看摘要，看你的想法是否與別人吻合？

（4）看完實驗結果，再思考有什么地方不完善？有沒有深入或拓展到底？下面還有什么問題可做，關鍵是你自己要思考，去發現。長期作戰，持之以恒。

為何牛血清在細胞培養實驗中如此受寵

作為各類種屬的高質量血清供應商，一般客戶咨詢血清購買時，我們都會推薦牛血清。而我公司zui為熱銷的血清產品中莫過于胎牛血清了，那么為何牛血清在細胞培養實驗中如此受寵呢？據酶聯生物技術員分析，主要原因有這五個方面：

1. 提供結合蛋白：作用是攜帶重要地低分子量物質，在細胞代謝過程中起重要作用。

2. 提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。

3. 提供基本營養物質：氨基酸、維生等是細胞生長必須的物質。

4. 提供激素和各種生長因子。

5. 對培養中的細胞起到某些保護作用。

針對第五個原因，我們來重點談談。有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止的消化作用。

我司技術員分析，這是因為已經被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了的粘度可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時，粘度起到重要作用。還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用。

特別說明到了有多位老師提出問題：人血清一定要加熱滅活嗎？不然會怎樣？其實對于它的加熱滅活是應該根據情況而定的。

很多朋友在使用實驗者認為一定需要加熱滅活，其實這個認知是不正確的，是否需要滅活是要根據情況而定。人們通常通過在56℃加熱30分鐘的辦法，來滅活其中的補體，以及其中可能的微生物（比如支原體）的污染。

加熱滅活帶來的問題是，其中的氨基酸、維生素和生長因子等也會不同程度的被破壞。

但是它的補體含量很低，即使在未稀釋的胎牛血清中，也觀察不到溶血現象。另外37℃的加熱能夠有效滅活補體。所以對它而言，并不需要通過專門的熱滅活來滅活其中的補體。

早期的人血清制備中的濾膜的孔徑大于0.22um，不能有效的去除支原體的污染。熱滅活可以去除支原體的污染。但是現在制備中的終端濾膜的孔徑為0.1um甚至小到0.04um，所以一般沒有支原體的污染。

通過以上，我們公司總結：除非有特別的情況，標準廠家生產的一般不需要加熱滅活。不過因考慮到其質量問題，為安全起見，還是以加熱滅活為好。

ELISA試劑盒的那點兒事

酶聯免疫吸附測定，又稱酶聯免疫吸附試驗，即ELISA，是酶免疫測定技術中應用的技術。1971年Engvall等人發表了使用ELISA定量測定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。

ELISA的原理

ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結合，檢測過程中，通常使用洗板的方式去除非結合物，最終酶促反應后的底物的顏色，對樣本中蛋白進行定性與定量。

不按說明書操作會造成的后果

每一個試劑盒里都會有對應的說明書，注意事項里大多都會提到“實驗嚴格按照說明書的操作進行”。為什么要嚴格按照說明書操作？為了更完整的回答這個問題，需要先回顧一下ELISA各種方法的原理。

根據試劑的來源和標本的性狀及檢測的具體條件，可設計出不同類型的檢測方法。大致分為以下幾類：

1.雙抗體夾心法測抗原

2.雙抗原夾心法測抗體

3.競爭法測抗原

4.間接法測抗體

總結如果不按說明書操作可能會出現的不滿意結果。

A. 先說最嚴重的操作錯誤，看錯或壓根不看試劑盒配套說明書，不按操作步驟加樣。比如把競爭法的試劑盒當作雙抗體夾心法來做，導致的結果就是整板顯示很強的藍色，無任何梯度。

B. 混用別的試劑盒里的試劑。不同廠家或者相同廠家的不同試劑盒，所含的試劑成分很可能是不一樣的，混用導致的結果是，浪費珍貴的樣本，樣品的回收率達不到預期值，如果混用不同試劑盒的酶復合物，會導致顯色過弱或過強，因為每種試劑盒所用酶復合物效價可能不一樣。

C. 不看文獻或者不做預實驗。比如某個試劑盒按照其靈敏度范圍和文獻報道推算樣本應該1:10稀釋，結果稀釋成1:1000，導致的結果是顯色過弱，結果不可用。

D. 不校準移液器及培養箱的溫度濕度。導致工作試劑濃度不準確，孵育溫度不合適，實驗帶來誤差。

E. 洗滌不充分，每孔洗液加樣過少，或者殘留。導致的結果是顯色過快，同時背景較高。

F. 手洗板時所用槍頭沒有懸空加入洗液，導致洗液污染，整個實驗失敗。

G. 剩余酶標板條未及時放入干燥袋，導致酶標板受潮，下一次再做時，顯色過弱或污染，CV值過高。

  ELISA常見主要試劑

1. 抗體：單抗特異性強，多抗結合性高，試劑盒需要高效的配對。

2. 2.抗原：大多為重組蛋白,細胞因子和待測樣本，高效標準品需NIBSC/WHO校準。

3. 3.顯色作用體系：首先辣根過氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強度熒光。

ELISA的類型

根據試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法，按照原理及操作，市面的方法有：

  1.間接法ELISA

是檢測抗體的方法，原理為利用酶標記的二抗以檢測已與固相結合的受檢抗體，顯色測定。優勢在于待測一抗無需標記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區別在于一抗酶標，檢測孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權衡使用。

2.夾心法ELISA

又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測樣本結合，后加入的檢測抗體結合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。

3.競爭法ELISA

小分子抗原與半抗原的檢測方法常用競爭法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結合的酶標抗原的量會減少，彼此形成競爭負相關體系，顯色物質也就越少，根據顯色物質的比例可擬合得到待測抗原含量。

4.其他方法

a.免疫抑制法測ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測抗原含量，原理類似與競爭法ELISA。

b.阻斷ELISA：目的檢測特異性抗體，也稱為競爭ELISA，原理為固相包被抗原，待測樣本與一抗酶標競爭孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中涉及該法。

c.此外有用于檢測IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術分類的TRFIA和多因子檢測等。

ELISA的評估

ELISA Kit的多指標決定了產品質量的優劣，優秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：

  1、準確性

ELISA Kit的多指標決定了產品質量的優劣，優秀的試劑盒需要對如下6大項指標進行測定評估，分析如下：

a.回收率：測定試劑盒對數據真實性的校準，過高或偏低會產生加樣和假性性的失準數據。

b.線性：測定試劑盒稀釋液與樣本微環境的的準確性，過高或偏低均會出現測定的偏差。

  2、精確度

a.板內精確度：評價單次實驗中，同一個已知濃度不同復孔的差異。

b.板間精確度：評價同一樣本，多次實驗的差異。

 3、精密度

檢測限：能顯著區分空白信號的最小信號值對應的濃度，用于評估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。

  4、特異性

a.交叉反應：評判特異性，不同分子與試劑盒抗體結合能力，交叉反應越大，特異性越差。

b.抗干擾能力：同源物的干擾，內源性物質對檢測系統的干擾。

  5.天然樣本檢測性

對天然樣本及合適的樣本類型檢測分析。對天然樣本類型確定，避免假陽性或假陰性結果。

  6、穩定性

試劑盒時效性和穩定性是對指標檢測的重要保障。穩定性越高，試劑盒存儲時間越久。

ELISA的應用

ELISA技術是特定靶標蛋白質定量的金標準，提供快速，穩定且易于分析的結果。可以對生物大分子/小分子的定量，對親和力測定評價或者篩選，還可對重組蛋白或細胞因子進行活性比對分析等運用。常應用于細胞因子，趨化因子，生長因子等檢測，同時應用于癌癥、干細胞、免疫學、神經學和信號轉導等研究領域的靶標。

ELISA實驗所用試劑-酶的底物與最后步驟詳解介紹！

1，酶的底物

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HRP的底物

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HRP催化過氧化物的氧化反應，代表性的過氧化物為H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

　OPD氧化后的產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

　　TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經HRP作用后，產物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優點為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩定1年。

豚鼠豐富重復蛋白(PRELP) ELISA 試劑盒

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AP的底物

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　　AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一時間。AP也有發熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

2，洗滌液

　　在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

3，　酶反應終止液

　　常用的HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

4，陽性對照品和陰性對照品

　　陽性對照品(positive control)和陰性對照品(negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。以人血清為標本的測定，對照品最好也為人血清，因為正常人血清在各種ELISA模式中可產生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國外試劑盒中的對照品多以復鈣人血漿(recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相似。陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質。

例如HBsAg檢測的陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質，其中加入一定量的待檢物質，此量最好在試劑說明書中標明。加入的量應與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。國外檢測HBsAg的ELISA試劑盒檢測敏感度約為0.5ng/ml，陽性對照品中含量約為10ng/ml。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

5，參考標準品

　　定量測定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質癌胚抗原測定等）應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的4-5個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。