穩(wěn)定細胞株篩選 流式

摘要：本實驗使用過表達human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa細胞。該病毒的表達框為pLenti-CMVOct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV啟動子驅(qū)動Oct-4-EGFP基因的表達， 同時由PGK啟動子驅(qū)動 puromycin抗性基因的表達。在感染HeLa細胞72h后，通過加入并維持2μg/μL的puromycin殺死未被有效感染的細胞。從而在puromycin藥物的維持下最終獲得Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達的混合穩(wěn)定株。

關鍵詞：Oct-4-EGFP，穩(wěn)定細胞株， HeLa，慢病毒

一、 實驗原理

外源基因在細胞中的表達可分為兩大類，一類是瞬時表達，一類是穩(wěn)定表達（永jiu表達）。前者外源 DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達到高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可長期表達目的基因。建立穩(wěn)定細胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物對靶細胞進行篩選。常用的抗性標記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉su（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin進行選擇性篩選。 傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉染后對靶細胞進行篩選， 最終獲得從單一細胞擴增起來的穩(wěn)定細胞株， 該方法陽性率低，周期長，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒感染細胞后需要逆轉錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組以后才能表達。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可以在短時間內(nèi)獲得高效率的穩(wěn)定細胞株。篩選得到的細胞或者可穩(wěn)定表達目的蛋白，用于蛋白的擴增和富集；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細胞株。

二、 實驗目的

通過慢病毒感染配合藥物篩選的方法獲得穩(wěn)定表達Oct-4-EGFP的HeLa穩(wěn)定細胞株。

三、 實驗步驟

實驗共分以下3個主要步驟：

1. 細胞鋪板 將HeLa細胞按30%的融合度接種到24孔板：

1) HeLa細胞配成1×105 cells/mL細胞懸液，待鋪板。

2) 每孔鋪500μL，即5×104 cells/well，鋪1塊24孔板。

2. 感染慢病毒 12~20h后感染慢病毒：

1) 根據(jù)公式計算病毒用量： （細胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。

2) 本實驗中MOI取10，吸去與加入病毒體積相同培養(yǎng)基。

3) 每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene終濃度達到5μg/mL。

4) 24h后換，棄去培養(yǎng)基后每孔加入500μL新鮮的培養(yǎng)基。

3. 穩(wěn)定株篩選

1) 72h以后，加入終濃度2μg/μL puromycin。每隔2-3天換一次終濃度2μg/μL puromycin新鮮培養(yǎng)基。

2) 藥物篩選約10天后，拍熒光照片。

3) 穩(wěn)定細胞株凍存。

四、 實驗結果

圖1. 慢病毒感染HeLa細胞72h后熒光照片，MOI為10

圖2. 慢病毒感染HeLa細胞，篩選10天后穩(wěn)定株熒光照片

結論：從圖1可以看到，在MOI為10條件下，HeLa的感染效率約為80%。根據(jù)圖2，使用puromycin藥物篩選10天后，表達目的基因的HeLa的比例在90%以上，且熒光亮度增強。Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達的HeLa細胞株篩選成功。

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