流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)原理

待測(cè)樣品(如細(xì)胞、染色體、精子或細(xì)菌等)經(jīng)熒光染料染色后制成樣品懸液，在一定壓力下通過(guò)殼液包圍 的進(jìn)樣管而進(jìn)入流動(dòng)室，排成單列的細(xì)胞，由流動(dòng)室的噴嘴噴出而成為細(xì)胞液流，并與入射激光束相交。 細(xì)胞被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，由放在與入射的激光束和細(xì)胞液流成 90°處的光學(xué)系統(tǒng)收集之。光學(xué)系統(tǒng)中的阻 斷濾片用于阻擋激發(fā)光；二色分光鏡及另一些阻斷濾片則用于選擇熒光波長(zhǎng)。熒光檢測(cè)器為光電倍增管。 散射光檢測(cè)器是光電二極管，用以收集前向散射光。小角度前向散射與細(xì)胞大小有關(guān)。

整個(gè)儀器用多道脈沖高度分析器處理熒光脈沖信號(hào)和光散射信號(hào)。測(cè)定的結(jié)果用單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、三維立體圖和輪廓（等高）圖來(lái)表示。

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選的原理是，由超聲振蕩器產(chǎn)生高頻振蕩，使流動(dòng)室發(fā)生振動(dòng)，把噴嘴噴出的細(xì)胞液流斷裂成一連串的均勻小液滴，有的液滴含有細(xì)胞。這些細(xì)胞在形成液滴前，光學(xué)系統(tǒng)已測(cè)定了它們的信號(hào)（代表細(xì)胞的性質(zhì)），如果測(cè)得信號(hào)與所選定的要進(jìn)行分選的細(xì)胞性質(zhì)符合，或者說(shuō)，如果發(fā)現(xiàn)了要進(jìn)行分選的細(xì)胞時(shí)則在這個(gè)選定細(xì)胞剛形成液滴時(shí)，儀器給整個(gè)液流充以短暫的正或負(fù)電荷。當(dāng)該液滴離開(kāi)液流后，其中被選定細(xì)胞的液滴就帶有電荷，而不被選定的細(xì)胞液滴則不帶電。帶有正電或負(fù)電的液滴通過(guò)高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)發(fā)生向陰極或向陽(yáng)極的偏轉(zhuǎn)，從而達(dá)到了分類收集細(xì)胞的目的。

1、檢測(cè)指標(biāo)： DNA倍體分析、DNA含量分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡；細(xì)胞表面抗原分析：淋巴細(xì)胞免疫分型、白血病及淋巴瘤免疫分型、血小板相關(guān)抗體分析、PNH相關(guān)抗原檢測(cè)（CD55/CD59）、胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)等。

2、樣本及來(lái)源：

1) 細(xì)胞數(shù)量達(dá)到檢測(cè)所需（細(xì)胞周期1x106、細(xì)胞凋亡3x106）,生長(zhǎng)良好，無(wú)污染，附有細(xì)胞生長(zhǎng)照片， 注明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目所需試劑盒；來(lái)源于人、小鼠、大鼠或其它。

2) 外周血：EDTA或肝素抗凝全血，5ml左右；來(lái)源于人、小鼠、大鼠或其它。

3）試劑：部分常用熒光探針，如PI等，我公司可免費(fèi)提供；特殊標(biāo)記物，如CD抗體等，用戶須另行購(gòu)買，我公司可以代購(gòu)；用戶所提供抗體應(yīng)可與樣本發(fā)生特異性識(shí)別反應(yīng)。

4）樣品包裝要求：細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中或操作前樣本于合適的條件保存。

檢測(cè)說(shuō)明：

1、用戶需要進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)須提前預(yù)約，同時(shí)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒎椒ǖ取ui低收費(fèi)300元。

2、我公司在正式接受實(shí)驗(yàn)委托一周內(nèi)交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果忠實(shí)于樣本的實(shí)際情況。

3、用戶須一次性全額預(yù)付實(shí)驗(yàn)費(fèi)。

4、由用戶提供的樣品或試劑所致的實(shí)驗(yàn)問(wèn)題由用戶負(fù)責(zé)。

5、請(qǐng)?jiān)诒碇姓f(shuō)明檢測(cè)具體要求，由于填寫資料不詳所致任何問(wèn)題由用戶負(fù)責(zé)。

6、請(qǐng)?jiān)谒蜆拥耐瑫r(shí)提供樣本來(lái)源及處理方法等信息，樣品檢測(cè)后原則上本公司不負(fù)責(zé)保存。

附：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣品推薦制備方法

A. 直接標(biāo)記抗體（FITC標(biāo)記抗體）：

(1)收集1×106個(gè)細(xì)胞，800rpm離心5min，4℃以上冷PBS洗一次。

(2)用4%多.聚.甲.醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細(xì)胞，800rpm離 心5min。

(3)用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細(xì)胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含 0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標(biāo)記抗體(5×105個(gè)細(xì)胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。 加入200ul 1% 多.聚.甲.醛固定，待測(cè)即可。

(4)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值,每管計(jì)數(shù)10,000.00個(gè)細(xì)胞。

B. 未標(biāo)記抗體間接免疫熒光標(biāo)記法：

(1)收集2×106個(gè)細(xì)胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細(xì)胞一次，800rpm離心5min。

(2)用2ml 4%多.聚.甲.醛室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm離心5min；

(3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。 (4)加入飽和劑量未標(biāo)記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細(xì)胞，800rpm離心 5min，洗去未結(jié)合一抗，重復(fù)一次。

(5)加入熒光標(biāo)記（FITC）標(biāo)記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩 次。

(6)加入0.5ml 1%多.聚.甲.醛重懸細(xì)胞；固定待測(cè)。

(7)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值,每管計(jì)數(shù)10,000.00個(gè)細(xì)胞。

C.細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：

(1)待測(cè)樣本制成單細(xì)胞懸液，然后200g離心5分鐘，棄上清。

(2)用4℃預(yù)冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小時(shí)。

(3)調(diào)整細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/毫升，取1毫升細(xì)胞懸液，用PBS洗三次，細(xì)胞重懸于1毫升PI染液中，37℃孵育30分鐘即可進(jìn)行流式分析。

(4)PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果：

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