真核表達載體構建 基因編輯

一、服務介紹

分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將 它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入適合的寄主體內得到復制與擴增， 然后再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

二、實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子 是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分 子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將 兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒 有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分為3步：首先，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復合 物；然后，酶—AMP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。

DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛小腸堿性磷酸 酶)CIP處理克服。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性.但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因 此人們找到了一個折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發揮連接酶的活性，又 兼顧到短暫配對結構的穩定。

三、實驗流程

目的DNA的擴增和純化；

連接反應；

電泳檢測連接產物。

四、客戶提供 樣本DNA，基因序列，試劑盒。

五、公司提供 構建好的載體，電泳膠圖，測序結果。

收費標準/服務周期/提供結果：

歡迎咨詢詳談，我們會根據您的方案及需求制定詳細的服務協議。

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