骨組織EDTA脫鈣（大）

病理實驗制片過程中，我們經常會遇到含鈣高的組織，因其組織結構質地太硬，組織中存有的鈣鹽會妨礙使用常規方法制作 良好切片，經固定后，必須除去鈣鹽使組織軟化，方能進行常規切片。

骨組織含鈣量最多，所以脫鈣是制作骨組織切片的重要環節，尤其需要進行免疫組化的骨組織。

為了達到骨組織既充分脫鈣，又保護骨組織的抗原不受破壞，需對骨組織固定之后再脫鈣或采用兼有固定與脫鈣的試劑處理，然后才能常規制片。

一、骨脫鈣方法

常見的脫鈣方法主要有單純酸類脫鈣法、混合酸類脫鈣法以及有機螯合劑法。

單純酸類脫鈣法：

主要有甲酸、硝酸、鹽酸等，硝酸和甲酸應用最多。

① 甲酸是一種使用范圍較廣的脫鈣劑，濃度一般10%，脫鈣速度較慢，適合骨髓組織脫鈣，不適合皮質骨的脫鈣。

② 硝酸脫鈣液缺點是形成亞硝酸而使溶液呈黃色，產生顏色即迅速影響脫鈣速度，且組織的黃染會妨礙隨后的染色，可在硝酸內加入0.1%尿素可以防止變黃而使之無色。

③ 鹽酸脫鈣液易使組織收縮，作用速度較快，用氯化鈉作為溶劑則效果良好。 混合酸類脫鈣法：

兩種酸類脫鈣劑一起使用，或在單純酸內加入另一種脫鈣劑或少量的其它試劑所配制的脫鈣液。 特點是脫鈣完quan，快速，防止纖維組織過度膨脹，減少組織破壞對染色結果的影響，通過加入不同的化學成分可以彌補單純酸類脫鈣劑的不足。

① 含甲酸脫鈣液（甲酸-福爾馬林液） 配方：甲酸 5－25ml 福爾馬林 5ml 蒸餾水 加至 100ml 5%的甲酸是良好的一種常規脫鈣劑，速度適當，組織損害小。當甲酸成分增至25%則增快脫鈣速度，加入甲醛可適當保護組織不受酸損害（注意：增加脫鈣速度只能靠犧牲細胞微細構造來獲得）。根據組織的厚度和鈣化程度，5%甲酸在2至4天可以完quan脫鈣。

② 含鹽酸脫鈣液（Von Ebnei氏液） 配方：

濃鹽酸 15ml 氯化鈉 7.5ml 蒸餾水加至 100ml

③ 含硝酸脫鈣液

配方1：福爾馬林 5ml 硝酸（比重1.41） 7.5－15ml 蒸餾水 加至 100ml 此配方中甲醛可以部分抑制硝酸的浸軟作用，同時具有固定作用，硝酸脫鈣迅速，組織不膨脹，掌握好可以直接脫水，不影響染色。不過盡量先洗去硝酸。

配方2：硝酸（用0.1尿素穩定） 5－10ml 蒸餾水 加至 100ml 此配方用作常規脫鈣劑，作用迅速，對組織不膨脹，對細胞的保存和染色比前者更好，能適用于多種染色技術，但盡量每日早晚更換一次新鮮溶液，一般1-3天完成。

④ 螯合劑脫鈣 EDTA（乙er胺四乙酸）是用于脫鈣的螯合劑。為有機化合物，有結合某些金屬的能力，能結合鈣鹽，15%的溶液即起脫鈣作用，組織用此方法脫鈣，對組織破壞性小，即放置數月亦不致引起對組織的破壞，對以后大多數的染色技術皆可得到滿意結果。

骨組織EDTA脫鈣（大）

二、骨脫鈣步驟

1. 取材：將骨組織固定于10%福爾馬林24小時后再鋸取厚度約0.5厘米骨片。

2. 固定：再以10%福爾馬林固定2天。

3. 將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。

4. 流水沖洗24小時/2%亞硫酸鈉水溶液中和，至少3小時，水洗至少1小時（除酸）。

5. 進行常規脫水，透明，浸蠟，切片。

四、鑒定脫鈣是否徹di 確定脫鈣“終點”有以下三種方法：

1. 常用的是簡單的方法――針刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力時，說明組織基本上脫鈣完quan，否則應繼續脫鈣。 靠組織的柔軟性測驗脫鈣作用靠不住，而且這種插入一根針以察覺鈣沉淀的方法會造成組織損傷。

2．用X射線檢查：看組織內是否仍有鈣質。

3．用化學實驗檢查： 取5ml脫鈣液用2M的NaOH（氫氧Hua鈉）調整至中性，再加5％草酸鈉或草酸銨1ml，液體混濁表示有鈣質。遲至5分鐘仍不混濁表示脫鈣液中不含有鈣質。 組織中仍有鈣質時，一定量的鈣離子會溶于脫鈣液中，游離的鈣會干擾脫鈣作用的完成。顯然，應在每次試驗時完quan更換，在試驗中必須經過2－3小時間隔讓鈣溶解。

五、優質脫鈣劑的標準

（a）wan全脫鈣；

（b）不損傷組織細胞或纖維；

（c）不妨礙以后的染色技術；

（d）適當的脫鈣速度。