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1. 概述
二抗用于通過與熒光團或酶的偶聯來可視化與靶標結合的一抗的定位。在選擇哪種二抗*適合實驗時，需要考慮多種因素，包括：
目標和宿主物種
靶標抗體類別
純化和/或交叉吸附
結合
用于的應用程序
可用的成像設備
多路復用
是否需要三級檢測系統
2. 選擇正確的目標和物種
二抗總是針對特定物種的抗體提出。選擇二抗時，應確保：
二抗針對與一抗宿主物種相同的物種進行。
二抗針對與一抗相同的免疫球蛋白類別（例如 IgG 或 IgM）進行檢測。
3. 凈化
您應確保二抗已以*認的方式純化。最常見的純化方法之一是通過蛋白A或G親和色譜，其中蛋白A和G與色譜柱中的樹脂結合并與免疫球蛋白特異性結合，同時洗滌血清中的其他蛋白質。
交叉吸附是指針對一系列非靶蛋白和免疫球蛋白篩選二抗。二抗通過含有固定化非靶蛋白的色譜柱，只有二抗沒有交叉反應性通過色譜柱。此步驟減少了脫靶結合，從而減少了免疫化學實驗中的背景染色。
4. 如何選擇合適的偶聯物
4.1 蛋白質印跡
首先要做的是讓自己了解可用的檢測設施，因為這將決定哪種偶聯物可能是*好的。三種主要的檢測系統包括：
增強型化學發光（ECL）：使用暗室和X射線膠片或使用基本的凝膠成像系統捕獲。
顯色檢測：使用標準掃描儀捕獲。
熒光檢測：使用**的凝膠成像系統捕獲。
有關不同檢測系統的概述，請參見圖1和表1。
圖1.可用于蛋白質免疫印跡的檢測方法概述
檢測方法 | 二級偶聯物 | 基質 | 考慮 |
增強型化學發光 （ECL） | 辣根過氧化物酶 | 基于魯米諾的ECL檢測解決方案 | 基于 HRP 的系統通常更靈敏且更易于使用 |
堿性磷酸酶 （AP） | 基于吖啶和1,2-二氧雜環丁烷的ECL檢測解決方案 | ||
顯 色 | 辣根過氧化物酶 | 3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺 （TMB）、氯-1-萘醇 （4CN） 或 3,3'-二氨基聯苯胺 （DAB） | 通常靈敏度低于ECL，更難使用。允許多路復用。 |
堿性磷酸酶 （AP） | 硝基藍四唑（NBT）或5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP） | ||
熒光 | 熒光基團（例如Alexa Fluor 680） | 那 | 多路復用和信號的持續時間可以比 ECL 更長 |
表 1.蛋白質免疫印跡檢測方法摘要
4.1.1 增強化學發光
增強型化學發光 （ECL） 利用辣根過氧化物酶 （HRP） 或堿性磷酸酶 （AP） 偶聯的二抗來催化產生光的反應。這是通過過冷CCD傳感器或X射線膠片檢測的，可以可視化印跡。
HRP偶聯次級因其即時信號生成和比AP偶聯次級更高的靈敏度而被*廣泛使用。使用AP偶聯副反應時的另一個考慮因素是它們與磷酸鹽緩沖液不兼容。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應與含有NaN的溶液一起使用3.
由于僅發射單一波長的光，因此不可能進行多重檢測，除非蛋白質靶標以不同的分子量存在，從而可以在同一膜上同時探測多個靶標（例如見圖2）。如果多個靶標的分子量相似，則需要剝離并重新探測印跡。
圖2.使用抗體檢測不同分子量靶標的ECL示例。使用小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）和小鼠單克隆抗GAPDH（HB9177）探測從各種組織裂解物轉移的蛋白質的膜。使用與HRP偶聯的山羊抗小鼠多克隆抗體完成可視化。由于NFL和GAPDH的分子量不同，這使得多路復用變得容易。NFL和GAPDH的不同信號強度需要不同的曝光時間，這意味著每個目標都需要單獨的面板。
4.1.2 顯色檢測
顯色檢測利用HRP和AP偶聯抗體催化反應，導致沉淀到膜上的有色最終產物。HRP的常見底物有：
3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）：產生具有高信噪比的藍色產品
氯-1-萘醇（4CN）：產生紫藍色產品。但是穩定性和靈敏度的問題
3,3'-二氨基聯苯胺（DAB）：產生棕色產品，可使用金屬離子增強。但是穩定性有問題。
AP 的常見基板有：
硝基藍四唑（NBT）/5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP）：產生強烈的紫色產品，耐褪色。
AP反應可以通過與酸性溶液孵育來停止，因此允許與不同顏色的反應產物進行多重反應。然而，AP共軛次級器件通常不如HRP檢測系統敏感，因此使用頻率要低得多。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應與含有NaN的溶液一起使用3.
4.1.3 熒光檢測
熒光檢測利用熒光團偶聯的二抗來檢測蛋白質條帶。由于PVDF在較低波長下自發熒光，用于WB檢測的熒光團往往具有高度紅移。ICC/IHC和WB中常用的熒光團列表詳見表1。請參閱成像系統規格，查找熒光團與激發/發射波長兼容的組合。
與ECL相比，熒光檢測的靈敏度較低，但通過使用具有足夠不同的激發/發射波長的熒光團可以輕松進行多重檢測。隨著時間的推移，熒光信號也比ECL信號更穩定，允許輕松重新成像，同時比ECL檢測變化更小，因為它不依賴于可能受多種因素影響的酶促反應。
4.2 免疫組織化學/免疫細胞化學
免疫組織化學和免疫細胞化學利用熒光或顯色介導的檢測。方法之間的選擇將取決于樣品制備、實驗目標和設備可用性（概述見表2和圖3）。
檢測方法 | 二級偶聯物 | 優勢 | 弊 |
顯 色 | 辣根過氧化物酶
堿性磷酸酶 （AP） | 通過信號放大實現更高的靈敏度
最終產品穩定性更高，允許更長的載玻片存儲時間 | 更耗時
更難多路復用 |
熒光 | 熒光基團（例如Alexa Fluor 488或DyLight 594） | 輕松多路復用
更快的實驗方案
高動態范圍 | 信號僅在幾天內穩定
某些組織中可能存在自發熒光問題。
熒光團可以光漂白 |
表 2.免疫組織化學和免疫細胞化學檢測方法概述。
圖3.可用于免疫組織化學和免疫細胞化學的檢測方法概述
4.2.1 熒光介導檢測
熒光介導檢測因其高度的靈活性和易于多路復用而非常受歡迎（例如參見圖4）。這種易于多路復用也使熒光檢測適用于共定位蛋白的分析。為免疫組織化學和免疫細胞化學選擇熒光團/熒光團對的第一步是檢查將用于成像的顯微鏡的規格。寬視場顯微鏡通常只配備有限的激發和發射濾光片，這將限制熒光團的選擇，而共聚焦顯微鏡通常受到可用于激發的激光通道數量的限制。激發和發射濾光片的激發和發射波長范圍需要與熒光團的激發和發射光譜重疊。有關IHC/ICC中常用熒光團（包括復染劑）的列表，請參見表3。
圖4.使用熒光檢測的免疫細胞化學示例。小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）與DyLight 488偶聯多克隆山羊抗小鼠二抗配對，用于檢測利用DAPI（HB0747）作為復染劑的培養大鼠神經元中的神經絲，以可視化DNA。
Dye | Maximal absorbance wavelength (nm) | Maximal emission wavelength (nm) | Visible Colour |
Alexa Fluor 350 | 346 | 442 | Blue |
Hoechst 33342 | 350 | 461 | Blue |
Hoechst 33258 | 352 | 461 | Blue |
DyLight 350 | 353 | 432 | Blue |
DAPI | 358 | 461 | Blue |
DyLight 405 | 400 | 420 | Blue |
Alexa Fluor 405 | 401 | 421 | Blue |
Alexa Fluor 430 | 433 | 541 | Green / Yellow |
EGFP | 488 | 507 | Green |
Cy2 | 489 | 506 | Green |
FITC | 492 | 520 | Green |
DyLight 488 | 493 | 518 | Green |
Alexa Fluor 488 | 496 | 519 | Green |
Alexa Fluor 532 | 532 | 553 | Yellow |
Cy3 | 550 | 570 | Yellow |
Alexa Fluor 546 | 556 | 573 | Orange |
Alexa Fluor 555 | 555 | 565 | Orange |
DyLight 550 | 562 | 576 | Orange |
TRITC | 557 | 576 | Orange |
Alexa Fluor 568 | 578 | 603 | Orange / Red |
Cy3.5 | 581 | 594 | Orange / Red |
mCherry | 587 | 610 | Red |
Texas Red | 589 | 615 | Red |
Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Red |
DyLight 594 | 593 | 618 | Red |
Alexa Fluor 610 | 612 | 628 | Red |
Alexa Fluor 633 | 632 | 647 | Far Red |
DyLight 633 | 638 | 658 | Far Red |
Alexa Fluor 635 | 633 | 647 | Far Red |
DRAQ5 | 646 | 697 | Far Red |
Alexa Fluor 647 | 650 | 665 | Far Red |
Cy5 | 650 | 670 | Far Red |
DyLight 650 | 652 | 672 | Far Red |
Alexa Fluor 660 | 663 | 690 | Far Red |
Cy5.5 | 675 | 694 | Far Red |
Alexa Fluor 680 | 679 | 702 | Near Infrared |
IRDye 680 | 680 | 694 | Far Red |
IRDye 700 | 680 | 697 | Far Red |
DyLight 680 | 692 | 712 | Near Infrared |
Alexa Fluor 700 | 702 | 723 | Near Infrared |
Cy7 | 743 | 767 | Near Infrared |
Alexa Fluor 750 | 749 | 775 | Near Infrared |
DyLight 755 | 754 | 776 | Near Infrared |
IRDye 750 | 766 | 776 | Near Infrared |
DyLight 800 | 777 | 794 | Near Infrared |
Alexa Fluor 790 | 784 | 814 | Near Infrared |
IRDye 800RS | 770 | 794 | Near Infrared |
IRDye 800CW | 778 | 786 | Near Infrared |
表 3.熒光免疫組化和免疫細胞化學常用的一些熒光團和復染劑總結
通過使用具有不同激發/發射光譜的成對熒光團來實現多路復用。在選擇熒光團對時，確保它們沒有重疊的激發/發射光譜至關重要（參見圖5，了解用于多重檢測的熒光團成功組合的示例）。如果熒光團的發射光譜重疊，則通道可能會滲入另一個通道，從而難以分辨來自哪種抗體的信號。雖然一些**的分析軟件能夠糾正這一點，但僅使用一個熒光基團的對照通常很有幫助，以便可以輕松檢測滲漏。
圖 5：用于多重實驗的合適熒光團組合示例。激發和發射光譜之間的重疊最小，這意味著成像時信號不太可能在通道之間滲漏。
4.2.2 顯色檢測
顯色檢測利用堿性磷酸酶（AP，使用 3-氨基-9-乙基咔唑 （AEC） 作為底物）或辣根過氧化物酶（HRP，使用 3,3' 二氨基聯苯胺 （DAB） 作為底物）介導的反應催化，導致有色底物沉積在組織切片上。由于這種彩色基材不會降解，這意味著載玻片可以保存數月而不會明顯損失信號強度。由于酶反應充當擴增步驟，顯色檢測具有很高的靈敏度，但是除非靶標位于不同的細胞類型或位置，否則很難進行多重檢測。在這種情況下，可以使用具有不同反應產物的底物成功多重。
5. 三級檢測
當靶標以低豐度表達或其檢測存在其他問題時，一種可能性是使用三級檢測系統。這些利用鏈霉親和素和生物素之間的*高親和力，在免疫化學過程中增加了另一個步驟。三級檢測使用生物素偶聯的二抗，然后由熒光團或酶偶聯的鏈霉親和素結合。這增加了一個額外的擴增步驟，因此在以前使用其他檢測方法的實驗不成功的情況下非常有用。
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