免疫熒光實(shí)驗(yàn)流程

單標(biāo)記方法

免疫熒光單標(biāo)記是指只標(biāo)記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡(jiǎn)單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問(wèn)題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會(huì)直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。

1、所需材料與試劑

a, 培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達(dá)到60%-70%的細(xì)胞。

b, 一抗、FITC或TRITC標(biāo)記的二抗。

c, 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min)。

d, 封閉液。

e, 0.01mol／LPBS緩沖液。

2、染色方法

a, 取出培養(yǎng)有細(xì)胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。

b, 加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain

c, 加入4%多聚甲醛試問(wèn)固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。

d，正常阻斷血清1:20封閉試問(wèn)20-30 min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清選擇與二抗同一種屬的正常血清。

e, 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過(guò)夜。抗體以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗(yàn)而定)。

f, 0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。

g, 加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。

h, 0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸干。

i, 90%甘油(PBS配制)封片。

j, 激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。

雙標(biāo)記方法

免疫熒光的雙標(biāo)記是指同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當(dāng)懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些，應(yīng)注意所用的一抗是來(lái)自不同種屬動(dòng)物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來(lái)自家兔；B抗體為單克隆抗體，來(lái)自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊，且盡量遠(yuǎn)離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來(lái)組合。通常情況下，染色時(shí)兩種一抗可以同時(shí)孵育，然后可以同時(shí)孵育兩種二抗。但當(dāng)染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強(qiáng)時(shí)，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同**熒光單標(biāo)記。

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細(xì)胞株或細(xì)胞爬片。注：細(xì)胞爬片不宜太密；細(xì)胞固定。組織切片，一抗

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實(shí)驗(yàn)周期：1-3周