供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 生物產業 |
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產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 目錄價(元) |
Puromycin (Solution 10 mg/mL) 嘌呤霉素鹽酸鹽溶液 | 60209ES60 | 10×1 mL | 1588 |
60209ES76 | 50×1 mL | 7985 | |
60209ES77 | 1×50 mL | 7385 |
產品描述
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)發酵代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素,通過抑制蛋白質合成而殺死革蘭氏陽性菌,各種動物和昆蟲細胞。某種特殊情況下有效作用大腸桿菌。作用機制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物,能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中。嘌呤霉素同A位點結合后,不會參與隨后的任何反應,從而導致蛋白質合成的提前終止并釋放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素產生菌Streptomyces alboniger內發現的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(PAC),賦予機體對嘌呤霉素產生抗性。這一特性如今普遍應用于篩選特定攜帶pac基因質粒的哺乳動物穩定轉染細胞株。
嘌呤霉素在細胞穩轉株篩選中的普遍應用與慢病毒載體的特性有關,現在商業化的慢病毒載體多數都攜帶pac基因。在某些特定情況下,嘌呤霉素亦可以用來篩選轉化攜帶pac基因質粒的大腸桿菌菌株。
本品是無菌的嘌呤霉素鹽酸鹽溶液(10 mg/mL in 20mM HEPES緩沖液,pH 6.2-6.8)。
產品性質
CAS 號(CAS NO.) | 58-58-2 |
分子式(Formula) | C22H29N7O5·2HCl |
分子量(Molecular weight) | 544.43 g/moL |
純度(Purity, HPLC) | >98% |
濃度(concentration) | 10 mg/mL |
結構式(Structure) |
運輸和保存方法
冰袋運輸。-20℃保存,1年有效期。
使用方法
1. 建議使用濃度
哺乳動物細胞:1-10 μg/mL,佳濃度需要殺滅曲線來確定。
大腸桿菌:LB瓊脂培養基篩選穩定轉化pac基因的大腸桿菌,使用濃度為125 μg/mL。
【注】:使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩轉株需要精確的pH值調節,而且受宿主細胞本身的影響。
2. 溶解方法
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液,經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝于-20℃凍存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/mL 的儲存液。
3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定(以shRNA轉染或者慢病毒轉導為例)
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關。為了篩選到穩定表達的 shRNA 細胞株,確定殺死未轉染/轉導細胞的低濃度嘌呤霉素至關重要。建議初次做實驗的客戶一定要建立適合自身實驗體系的殺死曲線(kill curve)。
1)Day 1:24孔板內以5~8×104 cells/孔的密度鋪板,鋪足夠量的孔以進行后續的梯度實驗。37℃細胞孵育過夜。
2)Day 2:①準備篩選培養基:含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基(如 0-15 μg/mL,至少 5 個梯度);②往孵育過夜后的細胞內更換新鮮配制的篩選培養基;之后37℃孵育細胞。
3)Day 4:更換新鮮的篩選培養基,并觀察細胞存活率。
4)根據細胞的生長狀態,約2-3天更換新鮮的篩選培養基。
5)每日監測細胞,觀察存活細胞率,從而確定抗生素篩選開始 4-6 天內有效殺死非轉染或所有非轉導細胞的藥物低濃度。
4. 哺乳動物穩定轉染細胞株的篩選
等轉染含有pac基因的質粒后,細胞在含有嘌呤霉素的培養基中增殖,以篩選出穩定轉染子。
1)細胞轉染 48 h 后,將細胞(原樣或稀釋)置于含有適當濃度嘌呤霉素的新鮮培養基中培養。
【注】:當細胞處于分裂活躍期時,抗生素作用明顯。細胞過于密集,抗生素產生的效力會明顯下降。好進行細胞分盤使其密度不超過25%。
2)每隔2-3天,移除和更換含有嘌呤霉素的培養基。
3)篩選7天后評估細胞形成的病灶。病灶可能需要額外的一周或者更多時間,這依賴于宿主細胞系和轉染篩選效率。
【注】:每日進行細胞生長狀態的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要 48 h,有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。
4)轉移和放置5-10個抗性克隆到一個35 mm的培養皿中,用選擇培養基繼續培養7天。此次富集培養是為日后的細胞毒性實驗做準備。
注意事項
1.嘌呤霉素為有毒化合物,操作時請小心拿放。
2.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3.本產品僅作科研用途!
HB220329