酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同。光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔極中的待測標本。該單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號，電信號經前置放大，對數放大，模數轉換等信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算，后由顯示器和打印機顯示結果。微處理機還通過控制電路控制機械驅動機構X方向和Y方向的運動來移動微孔板，從而實現自動進樣檢測過程。而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測，因此省去了X,Y方向的機械驅動機構和控制電路，從而使儀器更小巧，結構也更簡單。

光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。

檢測單位用OD值表示， OD是optical density(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD=log(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強度成下述關系:

E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度， Ιo 為在檢測物之前的光強度，Ι為從被檢測物出來的光強度。

OD值由下述公式計算:

c為檢測物的濃度 b為檢測物的厚度 a為摩爾因子在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長，在此波長下，此物質能夠吸收多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，檢測物光的吸收小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。

OD值由下述公式計算:

c為檢測物的濃度 b為檢測物的厚度 a為摩爾因子在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長，在此波長下，此物質能夠吸收多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，檢測物光的吸收小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。