iElisa 三聚氰胺檢測(cè)試劑盒

iElisa 三聚氰胺檢測(cè)試劑盒

1. 概要 三聚氰胺是一種化工原料，在食品和飼料中不 得人為添加，長(zhǎng)期攝入會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損 害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。中 國(guó)衛(wèi)生部等 5 部委 2011 年第 10 號(hào)公告中規(guī)定嬰兒 配方食品中三聚氰胺的*值為 1mg/kg，其他食品 中三聚氰胺的*值為 2.5mg/kg，高于上述*的 食品一律不得銷(xiāo)售。 2. 原理 測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原-抗體反應(yīng)。微孔板上包被有 三聚氰胺包被原。加入三聚氰胺（MEL）標(biāo)準(zhǔn)品或 樣品、和抗體后，游離的三聚氰胺與包被原競(jìng)爭(zhēng)結(jié) 合抗體，沒(méi)有結(jié)合的抗體及抗原被洗去，再加入酶 標(biāo)二抗，與抗體-包被原的結(jié)合物反應(yīng)，再次洗板后， 將未結(jié)合的酶標(biāo)二抗洗去。加入 TMB 底物顯藍(lán)色， 加入終止液后顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀在 450nm 處 檢測(cè)，吸光值與樣品中三聚氰胺的含量成負(fù)相關(guān)， 與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺的含量。 3. 試劑盒的組成 1) 包被有包被原的96微孔板：1塊（96 孔，12 條 ×8 孔） 2) 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：0 ng/ml、2.0ng/ml、 5.0ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150 ng/ml、 450ng/ml； 1 瓶 × 1.0ml 3) MEL抗體： 1 瓶 × 10ml 4) 酶標(biāo)二抗： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) 復(fù)溶液 1 瓶 × 50ml 7) MEL稀釋緩沖液A： 1 瓶 ×50ml 8) MEL稀釋緩沖液B： 1 瓶 ×50ml 9) 顯色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 10) 終止液： 1 瓶 × 7ml 11) 試劑盒說(shuō)明書(shū)： 1 份 12) 質(zhì)檢報(bào)告： 1 份 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標(biāo)儀 450nm（iElisa 全自動(dòng)酶標(biāo)儀或相當(dāng)者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉(zhuǎn)混合器（或者搖床、高速均質(zhì)器） —酶標(biāo)板振蕩器 —渦旋混合器 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過(guò)濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 試劑 —乙腈、正己烷、氫氧化鈉 —純水（蒸餾水、去離子水） 5. 樣品處理 樣品處理前的準(zhǔn)備： （1）1mol/L NaOH 溶液的配制： 稱(chēng)取 4.0g NaOH 加純水溶解并定容至 100ml。 （2）0.1 mol/L NaOH 溶液的配制： 稱(chēng)取 0.4g NaOH 加去離子水定容 100ml。 （3）乙腈-0.1 mol/L NaOH 溶液的配制： 84ml 乙腈和 16ml 0.1M NaOH 混合均勻。 （4）1 mol/L HCl 溶液 取 8.6ml 濃 HCl 加純水定容至 100ml。 5.1 牛奶樣品 1） 取 2.0ml 樣品至 50nl 離心管中。 2） 加入 8.0ml 樣品提取液（乙腈-0.1MNaOH）, 劇烈振蕩 15min，4000r/min 離心 10min。 3） 取 2.0ml 上清液在 50℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔?至*干燥。 4） 用 1.0ml 正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入 1.0ml 復(fù)溶液溶解混合 30s 5） 4000r/min 離心 10min，離心去除上層正己烷。 6） 取下層液 100μl，加 100μl MEL 稀釋緩沖液 A， 用渦旋混合器混勻。 7） 取 50μl 用于分析。 稀釋倍數(shù)：4 倍5.2 濃縮飼料 1） 將飼料樣品研碎，稱(chēng)取 2.0g 粉碎的飼料樣品置 于 50ml 離心管中，加入 2.0ml 1mol/L HCl， 加入 16.0ml 純水，置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器上振 蕩 10 分鐘（或使用高速均質(zhì)器均質(zhì) 3 分鐘，或 搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 4000r/min 離心 15min，取出 10.0ml 上清液并用 1mol/L NaOH 將 pH 值調(diào)至 6-8。（注：因飼料 樣品的不同，加入 1mol/L NaOH 的量有所差異， 根據(jù)情況調(diào)節(jié)，一般加入范圍是 0.5ml~1ml 之 間）。 3） 4000r/min 離心 15min。 4） 取上清液 100μl，加 400μl MEL 稀釋緩沖液 B， 用渦旋混合器混勻。 5） 取 50μl 進(jìn)行分析 稀釋倍數(shù)：50 5.3 組織樣品 1） 取 2.0g 勻漿組織樣本于 50ml 離心管中。 2） 加入8.0ml乙腈-0.1mol/L NaOH充分振蕩5min， 4000r/min 離心 10min。 3） 取 2.0ml 上清液在 50℃條件下氮?dú)饣蚩諝饬鞔?至*干燥。 4） 用 1.0ml 正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入 1.0ml 復(fù)溶液混合 30s，4000r/min 離心 10min， 去除上層正己烷相 5） 取 50μl 下層液用于分析。 稀釋倍數(shù)：2 6． 酶聯(lián)免疫分析程序 6.1 測(cè)定之前注意事項(xiàng) 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測(cè)定 程序中的要點(diǎn)。 4) 所有溫育過(guò)程應(yīng)避免陽(yáng)光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標(biāo)板。 6.2 溶液的配制 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用純水稀釋 10 倍后 使用。（例如：取 10 ml 濃縮液+90 ml 純水, 可以用 于 32 孔的檢測(cè)）。 6.3 測(cè)定程序 1) 將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入酶 標(biāo)板架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄 下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。未使用的酶標(biāo)板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品分別加至相應(yīng)的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 的 MEL 抗體， 加蓋，在室溫溫育 30 分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣 品必須使用新的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，每孔加入 250μl 稀釋好的洗 滌液，置于酶標(biāo)板振蕩器上振蕩 30 秒鐘（或 者手工振蕩），重復(fù)操作四次。洗完后用力在 吸水紙上拍干。 4) 然后各加入 100μl 酶標(biāo)二抗，加蓋，在室溫溫 育 30 分鐘（每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必須使用新的 吸頭）。 5) 重復(fù)洗板步驟 3） 6) 每孔加入100μl顯色底物，室溫避光溫育10分 鐘。 7) 每孔加入50μl 終止液。 8) 置于酶標(biāo)儀中，振蕩混勻，在450nm處測(cè)定吸 光度值（OD值），參比波長(zhǎng)630nm。（iElisa全 自動(dòng)酶標(biāo)儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結(jié)果判定 1) 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的 平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度值（ppb）為 X 軸，百 分吸光度值為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。相對(duì)應(yīng)每一 個(gè)樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回 歸方程法，計(jì)算出樣本溶液濃度。利用計(jì)算機(jī)專(zhuān)業(yè) 軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實(shí)際濃度為讀數(shù)結(jié)果乘以相應(yīng)稀釋倍 數(shù)。 3） 如果測(cè)定值超出檢測(cè)范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用相應(yīng)的稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋。 8. 注意事項(xiàng) 1) 室溫低于20℃或試劑及樣品未回到室溫（20- 25℃）會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏低。 2) 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥過(guò)久的情況， 則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3) 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn) 液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。 5) 終止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要混合使 用不同批次的試劑盒，這樣會(huì)引起測(cè)定結(jié)果不 準(zhǔn)確。 7) 試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 試劑盒的性能指標(biāo) 1）檢測(cè)限 LOD: 牛奶 5ppb（μg /kg），飼料 50ppb， 組織 2.0ppb。（LOD：空白樣品測(cè)定值+2 倍標(biāo)準(zhǔn) 偏差 SD） 2）定量限 LOQ: 牛奶 10ppb，飼料 100ppb，組織 4.0ppb。 3 ） 定 量 檢 測(cè) 范 圍 ： 牛 奶 10-1800ppb ，飼料 100-22500ppb，組織 4.0-900ppb 。