細(xì)胞程序性壞死整體實(shí)驗(yàn)

1、提供細(xì)胞程序性壞死整體實(shí)驗(yàn)方案：客戶根據(jù)課題標(biāo)書及需做實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項(xiàng)目方案，含課題申請書，實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)思路，實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)等與實(shí)驗(yàn)相關(guān)等內(nèi)容和資料?；蛘哂杉蚊缹?shí)驗(yàn)協(xié)助實(shí)驗(yàn)委托者完成細(xì)胞程序性壞死整體實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)。
2、項(xiàng)目評估報(bào)價(jià)：公司技術(shù)團(tuán)隊(duì)根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評估項(xiàng)目可行性，與客戶共同確定準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目執(zhí)行方案，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)價(jià)格。嘉美實(shí)驗(yàn)協(xié)助設(shè)計(jì)的課題直接給出準(zhǔn)確的報(bào)價(jià)。
3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預(yù)付部分費(fèi)用，做好實(shí)驗(yàn)初步準(zhǔn)備及項(xiàng)目預(yù)安排。
4、執(zhí)行服務(wù)項(xiàng)目：正式啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，全面展開實(shí)驗(yàn)，確保項(xiàng)目有效執(zhí)行。
5、溝通項(xiàng)目進(jìn)展：及時(shí)溝通反饋實(shí)驗(yàn)的Newest進(jìn)展，隨時(shí)了解掌控實(shí)驗(yàn)的Newest動(dòng)態(tài)。

6、完成項(xiàng)目交付：支付剩余尾款，交付實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正確應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提供售后服務(wù)。

一、細(xì)胞程序性壞死介紹

細(xì)胞是機(jī)體基本結(jié)構(gòu)和功能單位，細(xì)胞死亡是生命的基本過程，對多細(xì)胞生物的發(fā)育和自穩(wěn)平衡極為重要。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征改變可以將細(xì)胞死亡區(qū)分為凋亡( Apotosis) 和壞死( Necrosis) 。一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是主動(dòng)的程序性死亡方式，受控于死亡信號通路。而細(xì)胞壞死一直被認(rèn)為是一種隨機(jī)且不受基因調(diào)控的細(xì)胞死亡方式。在很多情況下，細(xì)胞凋亡和壞死共存。

近年研究發(fā)現(xiàn)一種非凋亡性的程序性死亡方式，細(xì)胞呈壞死樣的形態(tài)學(xué)改變，具有規(guī)律性的調(diào)控機(jī)制參與缺血性心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生，這種死亡方式被命名為程序性壞死(Necroptosis，Nec)。隨著細(xì)胞程序性壞死被發(fā)現(xiàn)，關(guān)于細(xì)胞程序性壞死的分子機(jī)制及其在生理病理?xiàng)l件下的作用越來越受到關(guān)注。

二、程序性細(xì)胞壞死通路相關(guān)疾病及臨床應(yīng)用前景

1、程序性細(xì)胞壞死與諸多疾病病理和器質(zhì)損傷有關(guān)。與RIP3敲除動(dòng)物相比, 野生型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在藥物引起的損傷、急性胰腺炎、缺血–再灌注損傷、TNF誘導(dǎo)的全身性炎癥 、末端回腸炎、視網(wǎng)膜脫落、視錐細(xì)胞退化、動(dòng)脈粥樣硬化和高雪氏病模型神經(jīng)元缺失中都表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的病癥。

2、RIP3介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死參與酒精性和非酒精性脂肪肝的肝損傷和炎癥。MLKL的T357/S358磷酸化已經(jīng)成為程序性細(xì)胞壞死的一個(gè)分子標(biāo)志, 利用人MLKL 磷酸化抗體也表明, 肝細(xì)胞的程序性細(xì)胞壞死確實(shí)參與了藥物誘導(dǎo)的肝臟損傷。雖然小鼠模型實(shí)驗(yàn)有力地證明了炎癥相關(guān)疾病涉及程序性細(xì)胞壞死, 但相關(guān)功能驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)急需研究人員開發(fā)出更多高特異性的細(xì)胞壞死分子標(biāo)記和特異性抑制劑, 這將為證實(shí)程序性細(xì)胞壞死確實(shí)參與人類疾病病理和闡明其致病機(jī)理提供便利。同時(shí), 程序性細(xì)胞壞死在宿主抗病毒免疫應(yīng)答中也具有重要作用。研究表明, rip3基因缺陷的小鼠更易感牛痘病毒。相應(yīng)地, 病毒也可以通過含 RHIM結(jié)構(gòu)域的蛋白抑制壞死, 有研究顯示, 巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus, MCMV)持續(xù)性感染是依賴于一種病毒蛋白與RIP3作用來阻斷其誘導(dǎo)壞死的功能。此外, 壞死細(xì)胞釋放的DAMPs可激活先天免疫和獲得性免疫, 從而加重了實(shí)質(zhì)Organ transplant中的許多不良免疫應(yīng)答。

3、抑制程序性細(xì)胞壞死可能會(huì)提高Organ transplant成功率。有研究表明, 腎臟rip3缺陷小鼠在異體移植后具有更好的器官功能和*無排斥存活率。但是阻斷程序性細(xì)胞壞死可能會(huì)有很大副作用, 因?yàn)橐浦不颊咄ǔＰ枰邮苊庖咭种浦委? 即使不阻斷程序性細(xì)胞壞死他們也飽受易感病毒及免疫力低下的困擾。移植器官從rip3缺失中獲益的機(jī)制需要在臨床試驗(yàn)?zāi)軌蛱禺愋园邢虺绦蛐约?xì)胞壞死之前闡明, 其臨床應(yīng)用尚需要更多研究。理論上, 可以從不同階段干擾壞死通路, 例如受體、RIP1、RIP3、MLKL、壞死復(fù)合體的組裝等環(huán)節(jié)。Nec-1是早鑒定的壞死抑制劑, 可特異性抑制RIP1的激酶活性。Nec-1具有一些與細(xì)胞死亡無關(guān)的副作用, 不利于其臨床應(yīng)用; 并且, 在一些 RIP3缺失的動(dòng)物模型中Nec-1卻會(huì)加速死亡。

4、研究人員開發(fā)出一些具有更高的親和性和特異性的第二代RIP1激酶抑制劑, 比如necrostatin-1s, 在 necrostatin-1s處理的TNF休克小鼠中并沒有觀察到病程加速的現(xiàn)象。RIP1的多效性提示我們尋找下游分子的抑制劑是一種更加具有吸引力的治療策略。其中, NSA是人MLKL的直接抑制劑, 可作為阻斷壞死的潛在藥物, 但其特異性和藥動(dòng)力學(xué)以及終的臨床應(yīng)用還有待研究。程序性細(xì)胞壞死介導(dǎo)的細(xì)胞死亡可能是由壞死復(fù)合體改變質(zhì)膜通透性直接造成的, 因此對于壞死復(fù)合體與膜的相互作用或者阻斷質(zhì)膜通道也許會(huì)產(chǎn)生新的藥物靶點(diǎn)。除了開發(fā)靶向通路中信號分子的小分子和質(zhì)膜通道抑制劑, 特異性抑制壞死受體也是一種有效的手段。除了TNFR1, 其他能誘導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死的受體和信號分子也正在探索中。

5、細(xì)胞程序化壞死的意思。與我們的直觀印象不同的是, 程序性細(xì)胞壞死并不總是有害的, 其在個(gè)體正常發(fā)育中有著*的意義。在臨床上, 誘導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死的發(fā)生與阻斷同樣重要。一些研究表明, 程序性細(xì)胞壞死通路在腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)程中通常是缺陷的。在 TNF-α和z-VAD聯(lián)合誘導(dǎo)下, 慢性淋巴細(xì)胞白血病 (chronic lymphocytic leukemia, CLL)細(xì)胞不能發(fā)生程序性細(xì)胞壞死, 并且CLL細(xì)胞中RIP3和CYLD表達(dá)量都顯著下調(diào) 。在458例非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma)患者中檢測到了rip3基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs), 這與非霍奇金淋巴瘤患病風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān), 說明rip3 基因變異很可能與該疾病的發(fā)生相關(guān)。

研究表明, 通過Shikonin誘導(dǎo)RIP1/RIP3依賴性的程序性細(xì)胞壞死可減少骨肉瘤(osteosarcoma)的腹部轉(zhuǎn)移。擴(kuò)散中的腫瘤細(xì)胞采用各種策略提升ATP水平并限制細(xì)胞ROS產(chǎn)生, 而在程序性細(xì)胞壞死中RIP3可以通過激活多種代謝酶調(diào)節(jié)TNF誘導(dǎo)的ROS生成。這種情況下, 腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移需要同時(shí)克服失巢凋亡 (anoikis)和程序性細(xì)胞壞死。然而目前關(guān)于程序性細(xì)胞壞死在腫瘤發(fā)展中的研究還很少, 對癌細(xì)胞如何失去程序性壞死通路完整性的機(jī)制的研究將有利于了解程序性細(xì)胞壞死在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。

6、總結(jié)與展望

  1）程序性細(xì)胞壞死是一條重要的受調(diào)控的細(xì)胞死亡通路, 其中還有很多問題有待深入研究和解決: 是什么機(jī)制調(diào)控壞死復(fù)合體的形成和活性？特定的泛素化反應(yīng)和各種酶在該通路中的作用是什么？ MLKL介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死執(zhí)行機(jī)制是什么？作為程序性細(xì)胞壞死執(zhí)行的核心分子, MLKL介導(dǎo)的質(zhì)膜破壞是否足以造成細(xì)胞死亡, 是否需要輔助因子？程序性細(xì)胞壞死在炎癥的起始、擴(kuò)大和慢性發(fā)展中如何作用？

  2）RIPs、程序性細(xì)胞壞死和炎癥復(fù)合體激活之間的關(guān)系又是什么？對程序性細(xì)胞壞死通路作用機(jī)制的研究依賴于對通路中各組分功能的研究, 通路中相關(guān)基因(如rip3、mlkl)敲除的動(dòng)物模型、特異性識(shí)別該通路激活和作用的抗體以及抑制程序性細(xì)胞壞死的小分子的發(fā)現(xiàn)將有助于對該通路更為細(xì)致的研究。程序性細(xì)胞壞死信號通路也因其在疾病中廣泛而重要的作用而具有很好的臨床應(yīng)用前景。

三、程序性細(xì)胞壞死誘導(dǎo)炎癥發(fā)生

1、程序性細(xì)胞壞死具有促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用, RIP3 或MLKL的缺失能阻斷細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)。在小鼠腸上皮細(xì)胞特異性敲除FADD會(huì)誘發(fā)自發(fā)結(jié)腸炎和回腸炎, 表現(xiàn)為Paneth細(xì)胞丟失; RIP3缺失能阻止這些小鼠中結(jié)腸和小腸的上皮細(xì)胞死亡和炎癥, 由此證明RIP3介導(dǎo)的上皮細(xì)胞程序性細(xì)胞壞死可促進(jìn)腸炎。上皮細(xì)胞特異性caspase-8敲除造成的Paneth細(xì)胞丟失和回腸炎隨后被證明是依賴于 RIP3而非初假設(shè)的依賴于TNFR1。

2、近一項(xiàng)研究中, 在克羅恩氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎或過敏性結(jié)腸炎患兒發(fā)炎的黏膜中, caspase-8表達(dá)減少, RIP3和MLKL表達(dá)量上調(diào), 說明程序性細(xì)胞壞死會(huì)放大炎癥, 加重這些腸道疾病病癥。表皮細(xì)胞特異性RIP1敲除造成的角質(zhì)細(xì)胞程序性細(xì)胞壞死和皮膚炎癥可被RIP3或MLKL缺失所阻斷, 這進(jìn)一步證明程序性細(xì)胞壞死會(huì)引發(fā)炎癥。已有的小鼠模型證實(shí), 角質(zhì)細(xì)胞的程序性細(xì)胞壞死有效地引發(fā)了皮膚炎癥, 這說明角質(zhì)細(xì)胞的程序性壞死可能也在人類皮膚炎癥中起作用。同時(shí), 角質(zhì)細(xì)胞的程序性細(xì)胞壞死在小鼠疾病模型和人類疾病中都有參與嚴(yán)重的皮膚不良藥物反應(yīng)。

除了腸道和皮膚上皮細(xì)胞, 其他類型細(xì)胞發(fā)生的程序性細(xì)胞壞死也可以引發(fā)炎癥, 比如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。 RIP3的缺失能改善缺血–再灌注誘導(dǎo)的損傷和炎癥, 延長腎臟和心臟異體移植存活時(shí)間, 這說明在移植排斥中, 移植細(xì)胞的程序性細(xì)胞壞死是引發(fā)炎癥的關(guān)鍵因素。程序性細(xì)胞壞死可以間接或者直接地引發(fā)炎癥。上皮屏障是腸道菌和黏膜免疫系統(tǒng)之間的重要屏障, 程序性細(xì)胞壞死通過破壞上皮屏障間接引發(fā)炎癥。無菌條件下, 死亡細(xì)胞通過釋放一類統(tǒng)稱為DAMPs的因子直接引發(fā)炎癥。

3、雖然有證據(jù)表明壞死細(xì)胞釋放了DAMPs, 而且某些特定的DAMPs 是體內(nèi)炎癥的重要介質(zhì), 但目前還沒有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以提供直接證據(jù)證明程序性細(xì)胞壞死是依賴于某些特定的DAMPs。這是因?yàn)? 不同DAMPs之間有功能交叉, 而且其中幾種DAMPs都在細(xì)胞內(nèi)有著重要作用, 所以相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)很難從遺傳學(xué)模型中獲得。事實(shí)上, 因?yàn)镠MGB1(一種典型的DAMP)在維持基因組穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞存活和防止組蛋白釋放等方面的重要作用, 骨髓、肝細(xì)胞和胰腺細(xì)胞特異性敲除 HMGB1會(huì)加速而非改善LPS誘導(dǎo)(或者損傷誘導(dǎo))的損傷和炎癥。抗體中和可能是合適的尋找特定DAMP(比如HMGB1)功能的方法, 雖然這種方法不能用于證明特定的壞亡細(xì)胞釋放的DAMP引發(fā)了炎癥。

四、程序性細(xì)胞壞死的執(zhí)行

1、為RIP3的特異性底物, MLKL是程序性細(xì)胞壞死的執(zhí)行者。其N-端為功能域, 人源 MLKL(hMLKL)含5個(gè)α-螺旋, 鼠源MLKL(mMLKL) 含4個(gè)α-螺旋, 其共同特點(diǎn)是由4個(gè)螺旋形成螺旋束, C-末端則為激酶樣結(jié)構(gòu)域, 兩者通過2個(gè)α-螺旋連接域相連。未被激活的MLKL以單體形式存在于胞質(zhì)中。RIP3自磷酸化激活后通過其激酶結(jié)構(gòu)域與MLKL激酶樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合, 并磷酸化hMLKL 激酶樣結(jié)構(gòu)域的Thr357/Ser358位點(diǎn)或mMLKL的 Ser345/347/352和Thr349位點(diǎn), 進(jìn)而推動(dòng)壞死程序的執(zhí)行。

2、MLKL單體磷酸化后發(fā)生寡聚, 其N-末端螺旋束可結(jié)合磷脂酰肌醇磷脂(phosphatidylinositol phosphate lipids, PIPs)和線粒體特異性的心磷脂 (cardiolipin, CL), 進(jìn)而從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到富含PIPs或 CL的質(zhì)膜上。化學(xué)抑制劑NSA(necrosulfonamide)與 hMLKL的4螺旋束結(jié)合, 擾亂MLKL的N-末端功能, 阻斷MLKL向質(zhì)膜轉(zhuǎn)移。同樣, 抑制PIPs的合成也會(huì)減少由MLKL誘導(dǎo)的壞死。不同的PIPs可將 MLKL定位到不同的細(xì)胞組分。

3、PI(4)P和PI(4,5)P2廣泛存在于質(zhì)膜表面, 導(dǎo)致壞死途徑激活后, 質(zhì)膜完整性丟失。CL主要分布于線粒體內(nèi)膜, 在壞死發(fā)生時(shí)可以與MLKL結(jié)合。同樣, 分布在不同細(xì)胞器的其他PIPs可能會(huì)募集寡聚MLKL到相應(yīng)的膜部位。雖然借助特異性識(shí)別人MLKL Ser358磷酸化位點(diǎn)的抗體, 研究證實(shí), 壞死細(xì)胞中活化的壞死復(fù)合體轉(zhuǎn)位到了多種細(xì)胞器和細(xì)胞膜上, 但有關(guān)MLKL激活后的分子事件及其轉(zhuǎn)移機(jī)制仍未被闡明。
 

4、關(guān)于寡聚MLKL如何造成程序性細(xì)胞壞死這一問題, 目前有多種不同的模型。初, MLKL被認(rèn)為與線粒體磷酸酶PGAM5(phosphoglyceratemutase family member 5)和發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白DRP1(dynamin-related protein 1) 介導(dǎo)的線粒體裂殖調(diào)控有關(guān)。研究表明, 線粒體內(nèi)膜間隙蛋白類似物Smac可加速壞死過程, 且PGAM5在壞死中可與RIP3/MLKL(包括壞死復(fù)合體)互作, 因此, 線粒體可能在壞死復(fù)合體形成上游發(fā)揮作用或參與壞死的執(zhí)行。

5、采用高劑量的 TNF、Smac類似物和泛caspase抑制劑z-VAD-FMK 在體外共同誘導(dǎo)壞死的方法可能會(huì)繞過或者掩蓋線粒體在壞死執(zhí)行中的作用。但由PARK2(parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase)造成的線粒體衰減和由 CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone)介導(dǎo)的線粒體自噬激活都不能阻止TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死, 這些證據(jù)并不支持線粒體產(chǎn)生的活性氧是終導(dǎo)致程序性細(xì)胞壞死元兇的假設(shè)。

6、除此之外, 還有其他兩種關(guān)于MLKL如何執(zhí)行細(xì)胞壞死的分子機(jī)制的模型: 一種認(rèn)為MLKL作為質(zhì)膜上募集Ca2+和 Na+ 離子通道的平臺(tái), 另一種則認(rèn)為MLKL通過其N- 末端4個(gè)α-螺旋域與帶負(fù)電的PIPs結(jié)合被募集到膜上直接作為成孔復(fù)合體發(fā)揮作用。然而, 在不含鈣元素和鈉元素的培養(yǎng)基中, 細(xì)胞仍可產(chǎn)生壞死, 雖然這個(gè)過程會(huì)有些延遲。

7、因此, 壞死細(xì)胞中觀察到的Ca2+和Na+ 流可能是壞死細(xì)胞膜完整性被破壞后由正常的鹽濃度梯度產(chǎn)生的。雖然觀察到的離子內(nèi)流可能對壞死表型有所貢獻(xiàn), 但是否會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡仍有待考證。在脂質(zhì)體通透實(shí)驗(yàn)中, MLKL(2- 154)和MLKL全長都能引起sulforhodamine B熒光的淬滅, 而預(yù)先將MLKL(2-154)或MLKL全長與NSA 孵育后, MLKL失去使脂質(zhì)體內(nèi)容物泄漏的能力, 表明MLKL確實(shí)可以在脂膜上成孔。成孔模型還需要更多的研究證明, 包括MLKL的4螺旋束在質(zhì)膜上的高分辨率結(jié)構(gòu)的獲取, MLKL使質(zhì)膜通透的機(jī)制是否與Bax相似等。

五、程序性細(xì)胞壞死信號通路的激活

程序性細(xì)胞壞死是由TNF-α、Fas/CD95和 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)等TNF 家族細(xì)胞因子與膜受體結(jié)合, 激活胞內(nèi)RIP家族激酶起始的。此外, LPS(lipopolysaccharide)、病毒DNA 和干擾素等均可激活程序性細(xì)胞壞死信號通路。

1. TNFR1介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死
TNF家族的成員具有多種生物學(xué)效應(yīng), 在由感染或組織損傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。

研究表明, TNF既可以通過激活NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞生存途徑, 也可以通過RIP1誘導(dǎo)caspases依賴性的細(xì)胞凋亡, 該過程不涉及RIP1的激酶活性。同時(shí), TNF 也可以激活壞死途徑(圖1), 該過程可被RIP1激酶抑制劑Nec-1阻斷, 表明TNF誘導(dǎo)的壞死途徑依賴于 RIP1的激酶活性。 TNF-α與細(xì)胞膜表面的TNF受 體(如TNFR1) 結(jié)合后, TNFR1通過其C-端死亡結(jié)構(gòu)域和接頭分子TRADD(TNFR1-associated death domain protein) 的死亡結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用, 進(jìn)而招募RIP1 、 TRAF2(TNFR-associated factor 2)/TRAF5 、 cIAP1(cellular inhibitor of apoptosis protein 1)/cIAP2以 及LUBAC復(fù) 合 體(the linear ubiquitin chain assembly complex), 形成TNFR1信號復(fù)合體I(complex I)。該復(fù)合體募集TAK1(the TGF activated kinase 1)- TAB(TAK1-binding protein)復(fù)合物以及由IKK1(IκB kinase 1)、IKK2和NEMO(NF-κB essential modulator) 組成的IKK復(fù)合物, 從而激活NF-κB信號通路和MAP 激酶級聯(lián)反應(yīng), 形成促炎癥信號并阻止細(xì)胞死亡。

RIP1在該信號通路中的功能是不依賴于其激酶活性的, 在這種情況下, RIP1更相當(dāng)于是下游信號通路的一個(gè)支架蛋白。死亡受體復(fù)合物裝配完成后, RIP1被快速多聚泛素化, 該過程對于IKK復(fù)合物的募集和NF-κB的活化都是必要的。TRAF2/3/5/6和 cIAPs均是E3泛素連接酶, 可對RIP1進(jìn)行K63多聚泛素鏈修飾, 其中cIAPs對RIP1的多聚泛素化并不*于K63修飾。當(dāng)RIP1上 的K63多聚泛素鏈被去泛素化酶 CYLD(cylindromatosis或者泛素修飾 酶A20切割后, TNFR1信號復(fù)合體I變得不穩(wěn)定, 導(dǎo)致RIP1 從細(xì)胞膜上解離, 形成由TRADD、FADD(Fasassociated protein with death domain)和pro-caspase-8 組成的胞質(zhì)復(fù)合體IIa(complex IIa), 從而激活細(xì)胞凋亡。

當(dāng)cIAPs、TAK1、NEMO的活性被抑制或者表達(dá)下調(diào)時(shí), TNF刺激會(huì)促進(jìn)由 RIP1、RIP3、FADD和pro-caspase-8組成的復(fù)合體 IIb(complex IIb)的形成, 啟動(dòng)依賴于RIP1激酶活性的凋亡。然而, 當(dāng)RIP3和MLKL的表達(dá)水平足夠高或caspase-8活性降低或缺失時(shí), 復(fù)合體IIb則促進(jìn)壞死復(fù)合體的形成。此時(shí), RIP3和RIP1會(huì)通過它們各自的RHIM(homotypic interaction motif)結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合, 隨后, 人源RIP3(hRIP3)在S227位點(diǎn)發(fā)生自磷酸化, 鼠源RIP3(mRIP3)則是在Ser232位點(diǎn), 進(jìn)而活化的RIP3募集MLKL, 激活壞死途徑。

有研究表明, caspase-8能通過切割RIP1、RIP3和CYLD抑制細(xì)胞壞死, 但該過程究竟如何抑制細(xì)胞壞死尚不清楚。近, rip1、rip3、caspase-8或 FADD組合型敲除小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RIP1的促細(xì)胞死亡和拮抗細(xì)胞死亡的功能。敲除rip1或 rip3能夠逆轉(zhuǎn)caspase-8或FADD敲除導(dǎo)致的小鼠胚胎致死, 由此證實(shí)了caspase-8或FADD對細(xì)胞壞死的負(fù)調(diào)節(jié)功能。

在rip1敲除小鼠中可觀察到出生后致死, 可能是由于rip1的敲除使得細(xì)胞失去了保護(hù)作用, 這一現(xiàn)象能被caspase-8和RIP3的雙基因敲除所逆轉(zhuǎn)。 FLIP(FADD-like interleukin-1β-converting enzyme-inhibitory protein)的表達(dá)水平對于程序性細(xì)胞壞死和凋亡的調(diào)控具有重要影響。FLIP的高水平表達(dá)會(huì)導(dǎo)致異聚復(fù)合體caspase-8-FLIP的形成, 該復(fù)合體具有催化活性, 但不能促進(jìn)caspase-8的*加工, 進(jìn)而阻斷依賴于復(fù)合體IIa的凋亡。Caspase-8促生存作用的精確機(jī)制仍不清楚, 但FLIP以及具有催化活性而非蛋白水解加工活性的caspase-8的存在是必需的。因此, FADD-caspase-8-FLIP介導(dǎo)的對復(fù)合體IIb的調(diào)控是阻斷細(xì)胞壞死的第二道重要屏障。

2. 其他死亡受體介導(dǎo)的程序性細(xì)胞壞死
在人類中, TNF超家族共有6種死亡受體: TNFR1、FAS、DR3、TRAILR1、TRAILR2和 DR6。TNFR1介導(dǎo)的信號通路會(huì)首先形成促生存信號復(fù)合物, 隨后在敏感細(xì)胞中形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物, 激活死亡通路。與此不同的是, FASL和FAS、 TRAIL和TRAILR1或TRAILR2的結(jié)合會(huì)通過胞內(nèi)段的DD domain和接頭蛋白FADD結(jié)合, 引起死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death-inducing signalling complex, DISC)的裝配, 從而募集和激活caspase-8并導(dǎo)致凋亡。在特殊條件如cIAPs缺少的情況下, 當(dāng)caspase-8 被抑制時(shí), 這些配體也會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。

此外, 當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激或受到損傷和感染時(shí), Toll 樣受體(TLRs)、NLRs[nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors]、 RGRs[retinoic acid-inducible gene I (RIG-I)-like receptors]和PKR(protein kinase R)等 復(fù) 合 物 被 激活, 部分受體也能引起細(xì)胞壞死。其中, 在caspase 活性被抑制 的 情況下, 脂多糖(LPS)或poly(I?C) (polyinosine-polycytidylic acid)分別激活TLR4或 TLR3, 活化的TLR3會(huì)形成一個(gè)內(nèi)涵體平臺(tái)募集胞質(zhì) 接頭分子TRIF[Toll/IL-1 receptor (TIR) domaincontaining adaptor protein inducing interferon (IFN)-β], TLR4也能通過TRIF傳遞信號。TRIF含有 RHIM結(jié)構(gòu)域, 能夠與RIP1、RIP3結(jié)合, 誘導(dǎo)壞死, 但該過程并不依賴于RIP1。然而, 通過Nec-1抑制RIP1激酶活性會(huì)阻斷LPS-poly(I?C)-zVAD-fmk誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死。

在巨噬細(xì)胞中異位表達(dá)無激酶活性的RIPK1-D138N也得到同樣的結(jié)果, 表明TRIF可以在缺乏RIP1的條件下直接募集和活化RIP3; 而當(dāng)其激酶活性被抑制時(shí), RIP1可以阻斷TLR3或TLR4 誘導(dǎo)的RIP3的激活。此外, DAI也包含RIHM結(jié)構(gòu)域, 既可以識(shí)別病毒雙鏈DNA誘導(dǎo)NF-κB的激活和I型干擾素分泌, 又可以誘導(dǎo)RIP3介導(dǎo)的細(xì)胞壞死。近的研究顯示, 在缺失caspase-8和FADD時(shí), I 型和II型干擾素均能在鼠胚胎成纖維細(xì)胞中通過PKR 結(jié)合RIP1并誘導(dǎo)RIP1-RIP3壞死復(fù)合體的形成。

然而在PKR缺乏的巨噬細(xì)胞中, 現(xiàn)有結(jié)果無法支持 RIP1在I型IFN-α受體調(diào)節(jié)的細(xì)胞壞死中發(fā)揮必要的作用。在某些類型的細(xì)胞中, 細(xì)胞壞死的調(diào)節(jié)可能涉及自分泌環(huán)路。在巨噬細(xì)胞中, LPS-TLR4、TNFTNFR1和poly(I?C)-TLR3調(diào)控的細(xì)胞壞死需要I型 IFN-α受體信號, 表明I型干擾素自分泌環(huán)路的存在。

此外 , Pam3CysK-TLR2、Flagellin-TLR5、CpGTLR9或etoposide的結(jié)合導(dǎo)致TNF產(chǎn)生的自分泌或旁分泌環(huán)路。在cIAPs受到抑制或caspase-8缺失時(shí), 細(xì)胞對TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死變得敏感。這些結(jié)果顯示, 細(xì)胞壞死在細(xì)胞感染、DNA損傷和炎癥反應(yīng)中起到了重要的調(diào)控作用。無論是TNFR1還是由其他受體介導(dǎo)的細(xì)胞壞死, RIP3激酶的激活都是程序性細(xì)胞壞死發(fā)生的關(guān)鍵步驟。上游信號通過其他含RHIM結(jié)構(gòu)域的蛋白與RIP3相互作用, 活化的RIP3通過磷酸化其底物 MLKL傳導(dǎo)壞死信號。

六、程序性細(xì)胞壞死在人類疾病中有何作用？

1、壞死的細(xì)胞會(huì)向周圍釋放其內(nèi)容物, 這些內(nèi)容物作為DAMPs(damage-associated molecular pattern molecules)可刺激周圍細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng), 激活機(jī)體免疫應(yīng)答。該文以TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死途徑為出發(fā)點(diǎn), 著重闡述程序性細(xì)胞壞死的分子機(jī)制及其在炎癥中的作用, 并回顧和展望了其在臨床診療中的可能性。

2、細(xì)胞死亡、增殖和分化之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)的重要條件。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為, 凋亡(apoptosis)是程序性細(xì)胞死亡的Only形式, 而壞死則是細(xì)胞在條件下發(fā)生的被動(dòng)死亡方式, 不受細(xì)胞內(nèi)外信號的調(diào)控。凋亡和壞死具有不同的形態(tài)學(xué)特征: 前者呈現(xiàn)出細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)固縮、形成凋亡小體并被鄰近細(xì)胞吞噬等特點(diǎn); 后者呈現(xiàn)出細(xì)胞體積增加、細(xì)胞器皺縮、質(zhì)膜崩解等特點(diǎn)。

更重要的是, 壞死發(fā)生以后, 細(xì)胞內(nèi)容物釋放并引起免疫反應(yīng), 繼而, 在血液中能檢測到損傷相關(guān)模式分子(damage-associated molecular pattern molecules, DAMPs) , 例如HMGB1(nuclear high mobility group box-1 proteins)和線粒體DNA等, 它們被認(rèn)為是細(xì)胞壞死發(fā)生的標(biāo)志。然而近年來, 越來越多的研究表明, 細(xì)胞壞死也是一種受細(xì)胞內(nèi)分子調(diào)控的細(xì)胞死亡途徑, 包括程序性細(xì)胞壞死(necroptosis)、 焦 亡(pyroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)以及依賴于線粒體通透性轉(zhuǎn)換 (mitochondria permeability transition, MPT)的壞死等途徑。

其中, 由RIP3(receptor interacting protein kinase 3)和MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)調(diào)控的程序性細(xì)胞壞死是目前研究得較為清晰的壞死途徑。壞死途徑由壞死復(fù)合體調(diào)控, 死亡受體[如腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1)、細(xì)胞表面Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)、DAI(DNA-dependent activator of IFN regulatory factors)等]與其對應(yīng)的配體結(jié)合, 促進(jìn)壞死復(fù)合體(necrosome)的裝配, 誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的發(fā) 生。RIP1(receptor interacting protein kinase 1)是壞死復(fù)合體中*個(gè)被鑒定的信號分子。它參與調(diào)控多條信號通路, 包括NF-κB(nuclear factor-κB)通路的活化、MAP激酶級聯(lián)反應(yīng)和依賴于caspase-8的凋亡途徑。

3、隨后, 激酶RIP3及其底物MLKL 的發(fā)現(xiàn), 使得這條通路的關(guān)鍵分子組成逐漸完善。程序性細(xì)胞壞死可能涉及一系列針對細(xì)胞內(nèi)感染的防御過程, 相關(guān)研究揭示, 程序性細(xì)胞壞死在多種人類疾病的病理學(xué)中發(fā)揮重要作用, 例如心肌梗死、中風(fēng)、動(dòng)脈硬化、缺血–再灌注損傷等。