分子機制的研究

1、提供各種分子機制整體實驗方案：客戶根據(jù)課題標書及需做實驗的主體內(nèi)容，擬定并提供初步的項目方案，含課題申請書，實驗方案，實驗設(shè)計，實驗思路，實驗文獻等與實驗相關(guān)等內(nèi)容和資料。或者由嘉美實驗協(xié)助實驗委托者完成各種分子機制整體實驗方案的設(shè)計。

2、項目評估報價：公司技術(shù)團隊根據(jù)客戶提供的相關(guān)資料，綜合評估項目可行性，與客戶共同確定準確的實驗項目執(zhí)行方案，給出準確的實驗價格。嘉美實驗協(xié)助設(shè)計的課題直接給出準確的報價。

3、簽訂服務(wù)協(xié)議：簽署服務(wù)協(xié)議并預付部分費用，做好實驗初步準備及項目預安排。

4、執(zhí)行服務(wù)項目：正式啟動實驗進程，全面展開實驗，確保項目有效執(zhí)行。

5、溝通項目進展：及時溝通反饋實驗的Newest進展，隨時了解掌控實驗的Newest動態(tài)。

6、完成項目交付：支付剩余尾款，交付實驗結(jié)果，正確應(yīng)用實驗結(jié)果，提供售后服務(wù)。  

一、分子機制研究介紹
1、分子機制研究概述
分子機制是指生物機體結(jié)構(gòu)組成部分的相互關(guān)系，以及其間發(fā)生的各種變化過程的物理、化學性質(zhì)和相互關(guān)系。現(xiàn)代分子醫(yī)學的目的，就是從分子機制的角度解釋疾病發(fā)生、發(fā)展等過程，并從中發(fā)展出相關(guān)的疾病風險預測、預防、診斷和治療技術(shù)。通過分子醫(yī)學實驗室研究，可利用分子、細胞生物學等研究手段闡明疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，篩選疾病診斷的生物標志物，確定疾病治療/干預的靶點，從而實現(xiàn)藥物的創(chuàng)制。在臨床上，醫(yī)生可基于分子醫(yī)學的臨床決策，通過基因組醫(yī)學實現(xiàn)風險預測，通過生物標志物實現(xiàn)疾病診斷，通過個體化醫(yī)療實現(xiàn)疾病治療。

2、分子醫(yī)學重點研究領(lǐng)域
  1）疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機制
  2）基因、遺傳與疾病的關(guān)系
  3）個體化治療的分子基礎(chǔ)
  4）治療有效性判斷的分子基礎(chǔ)

3、分子醫(yī)學發(fā)展方向：
1）從機理發(fā)現(xiàn)向醫(yī)學應(yīng)用的轉(zhuǎn)化
 2）新的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑

二、嘉美實驗分子機制研究的五個經(jīng)驗
五個經(jīng)驗分別為：信號通路; 明星分子; 中心法則; 工具分子; 具體位點;
1、信號通路
信號通路非常多，找到一條是關(guān)鍵，通路關(guān)系太復雜，講不清楚影響這個實驗設(shè)計。確定信號通路的方法有很多，特別是當我們已經(jīng)把一個基因的細胞和動物功能闡述清楚后：
  1）通過文獻報道或者已知經(jīng)驗，比如分子A的功能是影響細胞自噬，那么像PI3K-Akt-mTOR通路等就是我們可以直接通過閱讀綜述獲取的；
  2）通過RNA-seq或者芯片或者其它組學手段，篩選差異基因并對差異基因進行pathway或者GSEA富集分析，從而找到可能被基因A調(diào)控的信號通路；
  3）通過數(shù)據(jù)庫預測，比如基于與基因A存在共表達關(guān)系來分析周圍基因所參與的通路，從而得到A可能參與的通路，我們可以通過cbioportal/GEPIA對TCGA收錄腫瘤中的信息進行分析，也可以分析GEO等非腫瘤的共表達結(jié)果，甚至有一些網(wǎng)站直接收錄了這種共表達關(guān)系。

2、明星分子
明星分子選得好，文章分數(shù)才能高，中游節(jié)點較常選，上下連接左右逢源。明星分子的概念大而且含糊，盡管通路是一個大的網(wǎng)絡(luò)，但是總體上上下游關(guān)系還是存在的，如果簡單來劃分可以分為上游，中游和下游三段，三者之間沒有嚴格的界限，一般的通路常常出現(xiàn)分子類型有：配體與受體，激酶/磷酸酶（去/泛素化酶）與底物，轉(zhuǎn)錄因子和靶基因等，以TGFβ-Smad通路為例，如果把細胞膜和核膜作為上中下分類的區(qū)分點，可以粗略的這么劃分和標注：

那么在這個通路里面什么分子是明星分子呢？一般來說，大家選的重點集中在中游這個范圍內(nèi)，下游的分子（比如圖中的p15）一般用來作為細胞表型（細胞周期）的證據(jù)，可能考慮到膜蛋白研究的復雜和困難性，大家也很少選擇上游的分子，所以中游的分子就成了明星分子選擇的重點了，特別是通路的名字叫做TGFβ-Smad，所以很多研究就是圍繞Smad這個蛋白展開，比如Smad這個家族的蛋白即是轉(zhuǎn)錄因子，可以通過結(jié)合靶基因的DNA調(diào)控分子表達，其本身又可以被磷酸化發(fā)揮功能，所以又是激酶-底物這一關(guān)系中的底物這一角色，因此激酶-Smad-磷酸化的Smad（轉(zhuǎn)錄因子）-靶基因就成了一個信號軸。

  3、中心法則
中心法則像樓梯，三個水平無數(shù)級，從大到小逐層找，推理驗證需要多方面進行。

當我們選好明星分子以后，調(diào)控層次就是要考慮的問題了，這里說的調(diào)控層次就是圍繞中心法則展開對明星分子本身的探索，我們知道中心法則涉及到DNA-RNA-蛋白三個層面，根據(jù)調(diào)控的層次一般我們又分為轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，轉(zhuǎn)錄我們知道是發(fā)生在細胞核里面的。所以我們看到某個分子定位在細胞核時我們一般就從轉(zhuǎn)錄水平進行考慮，比如轉(zhuǎn)錄因子對DNA序列的結(jié)合，DNA甲基化、組蛋白修飾等等，而當RNA被轉(zhuǎn)錄出來后要經(jīng)過加工過程，比如可變剪接，miRNA介導的降解，mRNA翻譯成蛋白，蛋白合成后會被磷酸化修飾或者泛素化修飾從而激活或者降解等等，這些是轉(zhuǎn)錄后的水平。那么我們在確定明星分子后，一般來說需要首先確定的是變化發(fā)生在哪個層面，是RNA還是蛋白，是蛋白的產(chǎn)生（翻譯）、降解（比如泛素化）還是活化（比如磷酸化），從而把研究的焦點集中到明星分子的某個過程，這個層面是圍繞一個明星分子的前世今生來展開的。

4、工具分子
一個結(jié)果多個因素，工具分子一大群，具體哪個有作用，一般情況用免疫沉淀IP來驗證準確性。

確定了明星分子在哪個層面被調(diào)控后，就要找相應(yīng)的工具分子了，工具分子是指像酶（比如激酶、泛素酶、甲基化酶）、轉(zhuǎn)錄因子、翻譯因子、剪接因子等為主的一系列蛋白，每個系列的工具分子一般都有很多，比如泛素酶就有成百上千個，那具體是哪一個導致明星分子被泛素化呢？以免疫沉淀（IP）技術(shù)為基礎(chǔ)延伸出來的各種分子就是用來找這類工具分子的較常用策略，比如通過IP加質(zhì)譜鑒定與明星分子作用的泛素化酶，通過RNA pulldown加質(zhì)譜鑒定與RNA結(jié)合的工具蛋白（如翻譯因子和剪接因子），通過RIP-seq來尋找與蛋白結(jié)合的RNA，通過ChIP-Seq來尋找與蛋白結(jié)合的DNA序列（如靶基因）等等。找到工具分子后，作用的信號軸就有了：某基因（因素）通過（4）工具分子從（2）明星分子（3）某個層面調(diào)控（1）某條信號通路。

5、 具體位點
分子整體有作用，具體位點講不清，可以拆開組合來驗證。

這一步就是要進一步把明星分子和工具分子進行拆解，工具分子揍了明星分子一頓，具體是揍了一拳還是踢了一腳，工具分子的一拳打在了明星分子的臉上還是肚子上，這個是兩個要交代清楚的問題，所以就要把工具分子和明星分子中發(fā)揮功能的位點、序列或者結(jié)構(gòu)域找到，找到后就可以更加清楚的描述了：工具分子左拳打在了明星分子頭上，具體位置是打在了太陽穴上，把明星分子打死了，這樣導致一個以明星分子為中心的網(wǎng)絡(luò)（信號通路）出現(xiàn)崩潰或者癱瘓，異常（疾病）就出現(xiàn)了。所以我們在文章中常常看到要把蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)域進行分段，把RNA根據(jù)序列長度進行分段，然后再看他倆之間還有沒有作用。

三、分子機制研究的五個層次
層次一：相關(guān)性；一般對應(yīng)的文章分數(shù)在1-3分左右；
層次二：因果關(guān)系；一般對應(yīng)的文章分數(shù)在3-5分左右；
層次三：直接作用；一般對應(yīng)的文章分數(shù)在5-10分左右；
層次四：嵌套組合；一般對應(yīng)的文章分數(shù)在10-20分左右；
層次五：觀念創(chuàng)新；文章的層次是CNS級別。
 

1、層次一：相關(guān)性
兩個因素的相關(guān)性是做機制研究的*層關(guān)系，也是弱的關(guān)系。這里的因素可以是藥物、基因、現(xiàn)象等等，比如基因A的表達水平與肝癌腫瘤病人的預后、藥物的濃度與細胞凋亡的比率等等。對于疾病的研究來說，如果某因素與疾病進展或者預后有強相關(guān)性，就可能把該因素作為疾病進展或者預后的marker，比如甲胎蛋白AFP之于肝癌，所以有一類研究稱之為偽基礎(chǔ)研究，研究的名字比如：Prognostic Significance of gene A expression in B disease. 或者Association between gene A and B disease.

相關(guān)性是弱的邏輯聯(lián)系，因為兩個因素之間存在相關(guān)性有可能是*沒有邏輯的，比如北京的房價與肺癌的發(fā)病率之間的相關(guān)性。

2、層次二：因果關(guān)系
在相關(guān)性的基礎(chǔ)上深入的一層關(guān)系是因果關(guān)系，即因果關(guān)系是相關(guān)性的子集。如果A基因表達或者突變與B疾病之間存在相關(guān)性，那么有可能把A因素作為B疾病的biomarker；如果A基因是B疾病的原因，那么可以通過干預A基因影響B(tài)疾病進展。
  1）在分子機制研究中，因果關(guān)系的存在是要證明的*步，比如在進行某中藥通過AMPK信號通路抑制細胞增殖的研究中，為了說明某中藥調(diào)控AMPK信號通路，我們較常規(guī)的手段就是通過WB檢測AMPK信號通路以及下游分子的表達或者活化狀態(tài)，就是證明中藥Z劑量與AMPK通路分子表達的因果關(guān)系。
  2）為了證明因果關(guān)系的第二個部分就是挽救實驗，即如果上調(diào)A因素導致了B結(jié)果的出現(xiàn)，對A因素的下調(diào)是否可以逆轉(zhuǎn)B結(jié)果的出現(xiàn)。

3、層次三：直接作用
承接第二個層次，如果A因素是導致B結(jié)果出現(xiàn)的原因，那么A因素是直接原因呢還是間接原因？對應(yīng)到分子機制研究中就是這樣：A基因的上調(diào)導致了B蛋白的磷酸化，那么A基因直接與B相互作用介導的（直接作用）還是通過C介導的呢？
  1）為了證明這一點，通常用分子間的直接作用來驗證，比如蛋白與蛋白作用的co-IP，GSTPulldown，蛋白與RNA作用的RIP、RNApulldown，蛋白與DNA作用的CHIP、EMSA等等，就是為了判斷兩者之間的直接還是間接作用。
  2）在以分子為單位的研究中，第二部分就是“分子局部”研究，比如已經(jīng)證明了蛋白A與RNA B是直接結(jié)合的，“分子局部”研究就是確定蛋白A的什么局部（哪些氨基酸形成的結(jié)構(gòu)域）與RNA B的哪段序列直接結(jié)合。
做到這一步，絕大多數(shù)分子研究的深度就夠了，即使是top-levelCNS級別的文章要求也不過如此。

4、層次四：嵌套組合
既然第三層次分子機制的研究深度已經(jīng)夠CNS級別的文章了，第四層次就不僅僅是研究深度的問題了，而是故事的豐富度，有一個觀點就是從第三層次到第四層次的升級：單線到多線的過渡，即把幾個第三層次的單線研究嵌套組合為一個故事，第三層次要求把一個故事的一條線講清楚，第四層次要求把一個故事的多條線講清楚，而多條故事線的匯總形式有很多：比如雙頭蛇模式、反饋回路模式等等。

比如在第三層次的研究中，已經(jīng)通過各種實驗證明了lncRNAA通過抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達，在第四層次中雙頭蛇模式是：lncRNAA 除了通過抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達（層次三），還可以通過ceRNA的方式下調(diào)microRNAC表達從而促進B的表達；反饋回路模式則是：lncRNAA除了通過抑制蛋白B的降解上調(diào)B的表達（層次三），而上調(diào)表達的蛋白B促進了lncRNAXXX的轉(zhuǎn)錄，從而形成正反饋回路。

5、層次五：觀念創(chuàng)新
層次五就是高層次，即觀念層面的創(chuàng)新，一般到這個層次就是CNS級別了，比如新現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、兩個貌似沒有關(guān)系的現(xiàn)象之間聯(lián)系的揭示等，這點大家看CNS的文章應(yīng)該有感觸，舉個例子：外泌體的形成與細胞自噬之間有沒有關(guān)系呢？