大鼠內皮素(ET)ELISA檢測試劑盒實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠內皮素 (ET)水平。用純化的大鼠內皮素(ET)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入內皮素 (ET)再與 HRP標記的內皮素 (ET)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的內皮素 (ET)呈正相關。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠內皮素 (ET)濃度。

大鼠內皮素(ET)ELISA檢測試劑盒組成：

試劑盒組成  48 孔配置  96 孔配置  保存

說明書  1 份  1 份 

封板膜  2 片（48）  2 片（96） 

密封袋  1 個  1 個 

酶標包被板  1×48  1×96  2-8℃保存

標準品：135μg/L  0.5ml×1 瓶  0.5ml×1 瓶  2-8℃保存

標準品稀釋液  1.5ml×1 瓶  1.5ml×1 瓶  2-8℃保存

酶標試劑  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

樣品稀釋液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

顯色劑 A 液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

顯色劑 B 液  3 ml×1 瓶  6 ml×1 瓶  2-8℃保存

終止液  3ml×1 瓶  6ml×1 瓶  2-8℃保存

濃縮洗滌液  （20ml×20 倍）×1 瓶  （20ml×30 倍）×1 瓶  2-8℃保存

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分） 。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞

濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分

2鐘左右（2000-3000 轉/分） 。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分） 。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上

進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

大鼠內皮素(ET)ELISA檢測試劑盒操作步驟：

1.  標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在*、第二孔中分別加標

準品 100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后從*孔、第二

孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔， 再在第三、 第四孔分別加標準品稀釋液 50μl，

混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各

取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混

勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準

品稀釋液 50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。 （稀釋后各孔加樣量都為 50μl，

濃度分別為 90μg/L，60μg/L ，30μg/L，15μg/L，7.5μg/L） 。

2.  加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同） 、待測樣品孔。 在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl， 然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5 倍） 。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.  溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.  配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此

重復 5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。

7.  溫育：操作同 3。

8.  洗滌：操作同 5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15 分鐘.

10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色） 。

11. 測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。

注意事項 ：

1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間

控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值

大于標準品孔*孔的 OD 值） ，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計

3算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5） 。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9． 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算 ：

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD

值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

大鼠內皮素(ET)ELISA檢測試劑盒性能 ：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數 R 值為 0.95 以上。

2.批內與批見應分別小于 9%和 11%

檢測范圍 ：

3μg/L -120μg/L

保存條件及有效期 ：

1.試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6 個月