檢測抗多肽反應是否發生的zui簡單方法就是抗多肽ELISA。有兩種技術可以將多肽鏈接到ELISA板上。*種方法就是直接將多肽鏈接到盤上。但如果鏈接氨基酸恰好是抗原決定簇的一部分,則抗體無法和多肽進一步鏈接,這樣產生假陰性結果的可能性增加。第二種方法則是先將多肽與載體蛋白耦合,然后將多肽-蛋白耦合體鏈接到ELISA盤上。這種鏈接方法會使抗體-多肽的結合成功率提高,因為多肽不是直接嵌入盤膜,因而會更加暴露給抗體。這種方法因而更可靠,可重復性更高。需要注意的是,用于該方法的載體蛋白必須不同于用于免疫耦合的載體蛋白。這樣會避免血清中抗載體蛋白反應所導致的高背景反應。
當做血清檢測時,另一點需要記住的是,由于免疫多肽與自然多肽結構上的差別,檢測時的抗多肽反應與試劑的抗多肽反應可能是不同的。任何檢測,尤其是測定滴定量以決定收獲點時,必須包括針對天然狀態下蛋白的檢測。當然可以做針對天然狀態下蛋白的ELISA;但由于血清在不同檢測體系中表現會不一樣,因此在血清被日常使用的體系中進行蛋白識別鑒定。如果血清將用于免疫沉淀反應,就應該進行針對該反應的檢測。
產生具有優良性能的抗體。訂購定制的連接多肽,這樣您可以增加抗原的免疫原性。如果多肽小于6KD,我們特別*做連接。半抗原載體連接選擇包括:
· keyhole limpet hemocyanin (KLH)
· bovine serum albumin (BSA)
· thyroglobulin (THY)
· ovalbumin(OVA)
此外,您可以選擇多抗原多肽(MAP)連接,它提供一個有分支的賴氨酸核心可替代的多種構型的合成多肽。在決定使用MAP技術還是傳統的載體蛋白做連接時,請注意下列指導:
· 半光氨酸會形成非特異二硫鍵。如果您關注二硫鍵的構型,使用KLH
· 如果這種多肽是一直被成功地用來生產抗體,效仿已經使用的方法。
· 由于多肽通過C末端連接,而MAP技術有利于N末端或內部的多肽,不*使用在嚴格C末端連接的多肽上。連接載體也可能會導致一些空間障礙。使用KLH做C末端連接。
· 由于在傳統的C18 HPLC時,MAP多肽的性能更類似于大的蛋白,因而未提供純化。
長度
合適的多肽長度有利于優質合成,大部分的多肽抗原要求長度范圍在12-16個殘基,而且相對容易合成。盡管9個殘基或更短的多肽已經是有效的抗原,但是長于12到16氨基酸的多肽可能包含幾個決定簇。超過20殘基的多肽開始提出了更大的合成挑戰。
疏水殘基
當設計多肽時,請注意諸如Ala,Cys,Ile,Leu,Met,Phe和Val類殘基,它們會增加出現多肽可溶性問題的概率。注意保持疏水殘基低于50%
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