《Analytical Chemistry》 | HOOKE單細胞分選儀助力耐藥基因水平基因轉(zhuǎn)移研究
【化工儀器網(wǎng) 科技前沿】10月28日，中科院城市環(huán)境研究所崔麗研究員團隊?wèi)?yīng)用辰英核心產(chǎn)品——單細胞分選儀HOOKE PRECI SCS，在期刊《Analytical Chemistry》上發(fā)表文章“Phenotypic Tracking of Antibiotic Resistance Spread via Transformation from Environment to Clinic by Reverse D2O Single-Cell Raman Probing”。
01 研究背景
微生物耐藥是一個危害公共衛(wèi)生安全的性問題。耐藥基因(antibiotic resistance gene，ARG)在環(huán)境或臨床中出現(xiàn)并傳播擴散。在這一過程中，水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer，HGT)現(xiàn)象起著不可忽視的作用。HGT的一個主要途徑是轉(zhuǎn)化(transformation)——受體細菌攝取胞外DNA(extracelluar DNA，eDNA)。這些eDNA多是細菌主動分泌或者裂解過程中釋放的質(zhì)粒DNA以及片段化DNA，常常攜帶著ARG。環(huán)境充當(dāng)著ARG儲庫的角色，威脅著臨床治療。因此了解ARG從環(huán)境到臨床轉(zhuǎn)移的過程是必要的。
在上述問題的研究中，常規(guī)方法依賴耐藥菌的選擇性培養(yǎng)或是報告基因標(biāo)記eDNA技術(shù)。前者需要已知被篩選微生物的培養(yǎng)條件，且無法篩選出耐藥但擴增不活躍的微生物。后者需要對eDNA等進行改造，不能反應(yīng)實際的HGT情況。
近年新興了一種聯(lián)合正向D2O標(biāo)記的單細胞拉曼光譜方法用于微生物抗性區(qū)分。微生物利用環(huán)境中的D2O合成相關(guān)的生物分子，可以通過拉曼光譜的C-D帶(2040-2300 cm-1)進行表征。抗性環(huán)境中敏感菌與耐藥菌會表現(xiàn)出不同D2O攝入，進而表現(xiàn)出不同的C-D峰情況。然而微生物不僅攝入D2O，還會攝入其他含H元素的營養(yǎng)物質(zhì)，這導(dǎo)致單位時間C-D譜帶的增長較低。同時較短時間的孵育也降低了該方法的靈敏度。作者團隊改進并提出了反向D2O-單細胞-拉曼檢測技術(shù)(reverse D2O single-cell Raman (Raman-rD2O) probing，Raman-rD2O)。微生物預(yù)先在D2O中孵育，后置換為含抗生素的H2O環(huán)境孵育并被檢測。作者確定了該方法的有效性并利用該方法研究了HGT過程.。
02 實驗設(shè)計
這項研究中，為了評價微生物耐藥性，作者建立了Raman-rD2O方法，確定了其有效性，以及靈敏度。之后在大腸桿菌體系中確認(rèn)了水平基因轉(zhuǎn)移的情況。接著評價了與來自于復(fù)雜環(huán)境中質(zhì)粒共孵育的大腸桿菌對各抗生素(meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin)的耐藥情況，并確認(rèn)了該方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法更加準(zhǔn)確。后提出了一種用于反映ARGs傳播風(fēng)險的計算方法。
03 結(jié)果討論
Raman-rD2O方法區(qū)分耐藥菌以及敏感菌的靈敏度
對colistin耐藥的FIT10(B. cereus)以及colistin敏感的DH5α(E. coli)菌株進行D2O培養(yǎng)12h。轉(zhuǎn)移至含抗生素colistin的無D2O環(huán)境進行培養(yǎng)，取不同時間點進行拉曼圖譜采集，結(jié)果如圖 1。在C-D峰處可以看出，耐藥菌FIT10峰強逐漸變低，非耐藥菌DH5α無明顯變化。
圖 1. 預(yù)先標(biāo)記同位素D微生物在含0.125 mg/L colistin的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、0.5、1、4、8小時后的單細胞拉曼光譜(a)耐藥菌FIT10，(b)敏感菌DH5α。
采集含colistin培養(yǎng)條件下FIT10以及DH5α的單細胞拉曼圖譜并統(tǒng)計C-D比值(CD/(CD + CH))，結(jié)果如圖 2a-Ⅰ。另外比較了含ampicillin條件下的DH5α-Ampr以及DH5α數(shù)據(jù)，如圖 2a-Ⅲ?？梢钥闯鲈摲椒軌騾^(qū)分耐藥菌以及敏感菌，且適用不同抗生素。
從圖 2a-Ⅱ/Ⅲ以及2b數(shù)據(jù)，可以看出正向標(biāo)記方法4h后才能觀察到差異。因此反向標(biāo)記方法是優(yōu)于正向標(biāo)記的。
圖 2. (a-Ⅰ，a-Ⅲ) 反向D2O方法下，不同時間點的colistin耐藥FIT10、ampicilin耐藥DH5α-Ampr以及DH5α的C-D比值統(tǒng)計結(jié)果；(a-Ⅲ，a-Ⅳ) 正向D2O方法下結(jié)果；(b) 1×MIC抗生素濃度下培養(yǎng)1h，反向D2O、正向D2O的單細胞拉曼圖譜C-D區(qū)域結(jié)果。
利用Raman-rD2O方法揭示轉(zhuǎn)化過程中ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移
作者比較了實驗組JM109(E . coli)以及對照組DH5α、DH5α-Ampr 菌C-D比值。JM109預(yù)先與攜帶bla基因(編碼抗ampicilin蛋白)的pMD19-T質(zhì)粒共孵育。從圖 3可以看出，DH5α組維持高的C-D比值，DH5α-Ampr 組比值降至6.4%以下。而JM109組分為了高比值群體以及低比值群體。這意味著JM109組中部分微生物獲得了bla基因并表達，從而能在含ampicilin環(huán)境中進行代謝生長。
為了驗證這一假設(shè)，作者利用本公司(HOOKE instruments)產(chǎn)品單細胞分選儀(PRECI SCS)，對各樣品進行了單個細胞分選。對分選的單個微生物進行全基因組擴增后，通過PCR驗證bla基因的攜帶情況。從圖 3b可看出，DH5α組無bla基因，DH5α-Ampr 組攜帶bla基因，部分JM109組攜帶bla基因。這一結(jié)果印證了bla基因轉(zhuǎn)移的假設(shè)。
作者統(tǒng)計了不同采集個數(shù)下耐藥菌個數(shù)并計算了轉(zhuǎn)化頻率(Transformation Frequency = 轉(zhuǎn)化菌個數(shù)/(10×拉曼采集總數(shù))，10為微生物1h時擴增倍數(shù))。采集數(shù)目大于40時，轉(zhuǎn)化頻率趨近4.33 × 10-2。該結(jié)果與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法得到的5.07 × 10-2一致。
圖 3. (a)預(yù)標(biāo)記同位素D的E. coli DH5α(敏感對照)，E. coli DH5α-Ampr(抵抗對照)以及轉(zhuǎn)化了含bla基因質(zhì)粒的接受菌E. coli ，經(jīng)過含ampicillin的LB培養(yǎng)基孵育1h，采集拉曼光譜并統(tǒng)計C-D比率。每個點對應(yīng)一個拉曼結(jié)果。閾值6.4%為未經(jīng)過D標(biāo)記的抗性轉(zhuǎn)化子的C-D比值的平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差；(b)PCR產(chǎn)物(針對質(zhì)粒上bla基因)的電泳結(jié)果，1-3道為高C-D比值的敏感接受菌，4-6為小于10% C-D比值的耐藥接受菌，7為不含質(zhì)粒的E. coli DH5α，8為含bla基因的E. coli DH5α-Ampr；(c)質(zhì)粒(攜帶bla基因)的轉(zhuǎn)化頻率(線)以及轉(zhuǎn)化頻率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(柱)。利用單細胞Raman-rD2O方法對不同拉曼圖譜采集個數(shù)下結(jié)果進行了統(tǒng)計。
通過單細胞Raman-rD2O評價復(fù)雜環(huán)境中質(zhì)粒介導(dǎo)的eARGs轉(zhuǎn)化現(xiàn)象
作者提取了土壤中的質(zhì)粒并與E. coli共孵育。通過單細胞Raman-D2O，分析了不同抗生素下(meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin)的拉曼C-D比值。從圖 4a可以看出，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin組出現(xiàn)了水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象?？紤]到土壤等環(huán)境中質(zhì)粒對受體微生物增殖能力的影響，不同質(zhì)粒編碼導(dǎo)致同一抗性等問題，作者引入了傳播效率(Spread Efficiency = 轉(zhuǎn)化菌個數(shù)/拉曼采集總數(shù))來評估傳播風(fēng)險。就圖 4b結(jié)果來說，傳播效率ampicillin(1.5 × 10-1) > cefradine(8.6 × 10-2)和ciprofloxacin(6.7 × 10-2) >meropene(0)m和 vancomycin(0)。
作者同時計算了Raman rD2O方法的轉(zhuǎn)化效率，ampicillin (1.9 × 10-3)> ciprofloxacin (5.9 × 10-4) and cefradine (8.8 × 10-4) >meropenem and vancomycin (0) 。而傳統(tǒng)平皿培養(yǎng)方法下的轉(zhuǎn)化效率數(shù)值小于上述80-100倍。傳統(tǒng)方法低估了HGT的程度，一方面存在攜帶抗性基因但在環(huán)境下不可培養(yǎng)鑒定的微生物(viable but nonculturable，VBNC)，另一方面存在接受質(zhì)粒導(dǎo)致擴增速率大幅降低(1000倍)的微生物。而在傳統(tǒng)方法中過夜培養(yǎng)后，這種差異變得更加的明顯。
圖 4. (a) E. coli DH5α(敏感對照)C-D比值，以及接受菌E. coli 的C-D比值。接受菌經(jīng)同位素D預(yù)標(biāo)記后，與從土壤提取質(zhì)粒進行共孵育。后分別在meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin條件下孵育1h。每一個點對應(yīng)一個單細胞拉曼圖譜。C-D比值小于6.4%的為不帶D標(biāo)記的耐受轉(zhuǎn)化子；(b)攜帶抗meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin基因的質(zhì)粒的傳播效率。星號表示比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(單因素方差分析ANOVA，P< 0.001)。
04 結(jié)論
利用單細胞拉曼反向D2O檢測方法能夠可靠且快速的從表型上追蹤耐藥從環(huán)境到臨床的擴散。方法具有很高的靈敏度，能夠在大量受體菌種識別出那些少量的抗性轉(zhuǎn)化子。單細胞水平的檢測避免了繁瑣的培養(yǎng)過程，可以直接計算傳播效率，能夠表征臨床相關(guān)抗生素的不同風(fēng)險。該方法后續(xù)未來可用于破解影響抗性質(zhì)粒轉(zhuǎn)移以及持續(xù)的因素。通過與基因型研究的聯(lián)系，能更好的理解環(huán)境質(zhì)體(environmental plastidome)傳播風(fēng)險。也是一種研究HGT機制的新手段。
辰英科儀自主研制的單細胞分選儀PRECI SCS具有獨特的可視化分選功能，所見即所得，精準(zhǔn)實現(xiàn)目標(biāo)細胞的逐一分離。采用獨特的激光與物質(zhì)相互作用原理，對于復(fù)雜生物樣本中形態(tài)各異的細胞，可實現(xiàn)非標(biāo)記狀態(tài)下的精準(zhǔn)分離。對于百納米級的單個微生物細胞也同樣適用。
圖5. 單細胞分選儀HOOKE PRECI SCS
圖6. 拉曼單細胞分選儀HOOKE PRECI SCS-R300
PRECI SCS具有可視化、廣泛適用等特點。分選過程不依賴標(biāo)記，可與形態(tài)、拉曼、熒光等多種識別方式結(jié)合，多種機型可選，滿足不同應(yīng)用需求。搭載潛心研制的HOOKE IntP智能軟件，實現(xiàn)單細胞圖像智能識別、一鍵自動分選、全自動細胞獲取等。設(shè)備操作流程簡易，為單細胞測序、未培養(yǎng)微生物開發(fā)、工程細胞篩選、細胞圖譜繪制等研究提供解決方案，助力前沿科學(xué)研究。
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