資料簡介
鹽酸克侖特羅(clenbuterolhydrochloride,CL),又名氨哮素、瘦肉精、雙氯醇胺等,化學名為α [(叔丁氨基)甲基] 4 氨基 3,5 二氯苯甲醇鹽酸鹽,是一種β2 受體激動藥。其松弛支氣管平滑肌作用強而持久,臨床上主要用于治療支氣管哮喘。由于藥物半衰期長,在體內代謝慢,臨床應用時,可能出現肌肉震顫、心慌、心悸、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀,特別是對于高血壓、心臟病、甲亢、青光眼、前列腺肥大等疾病患者危險性較大,可能會加重病情,導致意外,所以對CL的臨床血藥濃度監測非常重要。本實驗采用HPLC-電化學法測定CL血藥濃度,參考有關資料,著重對人血漿中CL的提取方法、色譜條件、內標物質的選擇以及方法的準確性和重現性等進行了研究,并對患者血漿樣本進行分析。
1材料
1.1儀器
島津LC 6A液相色譜儀,LED 6A電化學檢測器,JS 3030色譜工作站,超聲波儀,恒溫水浴箱(上海和呈儀器生產),高速離心機。
1.2藥品與試劑
鹽酸克侖特羅對照品(新鄉同心制藥廠,批號20030601,純度98.7%),乙腈(色譜純),辛基磺酸鈉(Sigma),其余試劑均為分析純。CL對照品和對苯二酚內標均用0.02mol?L-1HCl配制成標準儲備液。
2方法與結果
2.1色譜條件
色譜柱:NucleodurC18(250mm×4.6mm,10μm);流動相:磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈=7∶3(V/V);磷酸二氫鉀緩沖液內含0.02mol?L-1磷酸二氫鉀,0.15mmol?L-1Na2EDTA,0.2mmol?L-1辛基磺酸鈉,pH5.0,并通過0.45μm的濾膜過濾后與乙腈按比例混合,流速1.2mL?min-1,檢測器電位0.80V(Ag/AgCl電極),進樣量20μL。
2.2血漿樣本的處理
取15mL離心試管依次加入0.2mol?L-1NaOH溶液2mL,0.5mg?L-1對苯二酚內標液100μL,肝素抗凝血漿樣本1mL,混勻,加乙醚-乙醇(8∶2)提取液8mL,封蓋,用超聲波儀提取20min,3000r?min-1離心15min;取上清液轉移至另一潔凈試管中,加入0 .2mol?L-1NaOH2mL混勻洗滌,3000r?min-1離心5min,取上清液層轉移至一潔凈試管中,置60℃水浴上通N2揮干,殘留用0.1mL流動相重組后,取20μL供液相色譜儀測定,用內標法以峰面積定量。
2.3系統適應性試驗
通過對流動相的配比、pH、流速、檢測電位的調整實驗,確定在上述色譜條件下,空白血漿加內標及CL對照品的測試結果見圖1。內標及CL保留時間分別為4.975、5.652min。兩者分離度>5,達到基線分離,且無空白干擾。
2.4標準曲線的繪制
取空白血漿7份,每份1mL,各加入100μL內標液,分別加入適量標準溶液使之配成5、10、20、40、60、100、120μg?L-1的標準系列;按2.2項下操作測定,由色譜工作站直接求出CL對內標的峰面積比值(Y)與相應的濃度比值(X)的回歸方程,Y=0.753X+0.011,r=0.9993。檢出限為0.015μg?L-1(rSN=3),線性范圍為1.5~120μg?L-1。
2.5回收率和精密度的測定
對高、中、低3份CL含量為5、20、40μg?L-1的標準血樣分別按本法檢測,其回收率分別為90.5%、94.7%、96.3%,平均為93.8%。同時3份樣本按本法分別平行檢測5次,RSD分別為2.6%、3.7%、4.2%。
2.6樣品測定
我們采用該方法測定了3例患者口服CL后的血藥濃度,患者每次口服該藥30μg,服藥后2.5h和24h靜脈取血。結果見表1。
3討論
國內外文獻報道的HPLC法測定生物樣本CL的前處理方法中,采用乙醚-丁醇、己烷-乙酸乙酯等溶劑體系,提取回收率均偏低,影響檢測靈敏度。因為鹽酸克侖特羅在中性、酸性下易溶于水、甲醇、乙醇,不溶于乙醚等,而在堿性下可溶于乙醚。本實驗在堿性條件下用乙醚∶乙醇混合比分別為6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的4種混合提取液對同一份加標樣品,各作3次平行對比測定。其平均回收率分別90.6%、92.2%、95.3%、93.6%。結果表明乙醚∶乙醇混合比8∶2作提取液時,其結果*。
本法處理樣品簡單,測定準確、快速,采用電化學檢測器檢測,專屬性強,靈敏度高,且不受其他藥物的干擾,更適用于臨床鹽酸克侖特羅血藥濃度的監測。
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