兔腫瘤壞死因子αelisa檢測試劑盒說明書

樣本實驗前準備：

ELISA試劑盒液體樣本：包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。

（1）血清

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

（2）血漿：

應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

（3）尿液：

用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。

（4）細胞培養上清：

檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。

（5）培養細胞

檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

（6）組織標本

切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

elisa試劑盒常見組成部分：

1）酶和底物：在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP。

2）抗體：在ELISA中應用的抗體可分為多克隆抗體(多抗)和單克隆抗體(單抗)。

3）抗原：在ELISA中應用的抗原要求有較高的特異性、親和力和純度。主要有三類，即自然抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。

4 人E選擇素(E-Selectin/CD62E)檢測試劑盒包被：將免疫活性物質(抗原或抗體)結合于固相載體上的過程稱為包被。常用的材料有聚苯乙烯、硝酸纖維薄膜等；常用的方法有吸附法、化學交聯法及親和素間接包被法

5）固相載體：固相載體是ELISA中用以分離結合標記物和游離標記物的主要手段，應與各種免疫活性物質有良好的結合性能并且不改變其免疫活性。常用的固相載體有聚苯乙烯塑料和硝酸纖維素膜。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在di一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在di一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從di一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為180 ng/L，120 ng/L ，60 ng/L，30 ng/，15 ng/L）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘。

注意事項

1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5. 底物請避光保存。

6. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

7. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

8. 本試劑不同批號組分不得混用。

9.如需代測或者樣本暫時不測定，可立即低溫凍存，溫度越低越好，中間避免反復凍融，-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。

10.試劑使用須知：

11.（1）請參照相關法規、文獻、MSDS等信息，理解并掌握好試劑的特性，再進行安全操作。

12.（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話，更加注意其他保管和管理。

13.（3）萬一試劑操作者并非專業技術人員。必須在專業人士的指導監督下進行操作。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑，應按照相關法律法規正當處理。

14.（4）購買后，請務必確認標簽上的注意事項；做好預防顛倒，摔壞的措施和管理體制；在使用前再次確認標簽上的注意事項，做好必要的安全對策；對沒有標明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進行操作；必須帶好防護用具，小心翼翼進行操作。