Actin（肌動蛋白）是細胞骨架蛋白的重要組成蛋白之一，分子量為43kDa，在物種之間高度保守。根據Actin的功能和組織定位的不同，主要分為三類：α-肌動蛋白(α-actin)、β-肌動蛋白(β-actin)和γ-膜肌動蛋白(γ-smooth muscle actin)。

1）α-actin存在于肌肉組織中，包括平滑肌和心肌，參與了細胞的收縮和肌肉運動；

2）β-actin廣泛存在于細胞各個部位，包括細胞質和細胞骨架，它參與了多種細胞活動，如細胞形態變化、細胞遷移和細胞分裂；

3）γ-smooth muscle actin主要表達于平滑肌細胞，參與平滑肌收縮和組織修復。

其中，β-actin常被用作內參蛋白，從而被大家所熟知，它可以作為實驗中蛋白負載量和表達水平的標準參照物。在WB實驗過程中，通過檢測和對比目標蛋白與β-肌動蛋白的相對表達水平，可以對目標蛋白的表達進行定量和比較。然而，Actin的作用遠遠不止內參蛋白那么簡單，根據Nature、Science、Cell等zhi名期刊上發布的相關研究結果表明，它在囊泡運動、細胞遷移、吞噬和細胞內運輸等生物過程和疾病研究中都發揮著重要的功能作用。接下來，就和大家一起來聊聊關于Actin那些你不知道的事兒~

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一、Actin的研究方案

1、肌動蛋白聚合物的檢測

在生理條件下，球狀肌動蛋白(G-actin)很容易聚合成絲狀肌動蛋白(F-actin)，同時發生ATP水解（圖1）。肌動蛋白在體外可以從兩端聚合，由于聚合速度快慢的差異，導致肌動蛋白絲具有內在極性，我們通常將聚合速度快的一端稱為正端或倒鉤端，而聚合速度慢的那一端稱為負端或jian端。

圖1 肌動蛋白絲的雙螺旋結構

肌動蛋白的聚合取決于肌動蛋白單體對細絲末端的親和力，肌動蛋白單體存在一個臨界濃度(CC)，當低于該濃度，肌動蛋白不會聚合；當單體濃度高于CC時，肌動蛋白將發生聚合，直到游離單體濃度等于CC。然而，當我們在體外研究肌動蛋白時，它的程度則取決于所使用的條件。舉個例子，在4°C條件下，肌動蛋白在2mM Mg²⁺和50mM KCl溶液中的CC值為0.03mg/mL，當這些離子不存在時，CC值則會超過3.0mg/mL。因此，我們可以通過改變離子類型和濃度，來改變聚合物的數量。

通過檢測肌動蛋白聚合物，可以評估不同化合物對肌動蛋白功能的影響，目前常用的檢測方法有以下4種：

1）芘結合熒光法

較通用、較靈敏、最易于操作的檢測方法，對照樣本和測試樣本與少量芘連接的肌動蛋白混合，然后用熒光計跟蹤聚合情況。芘肌動蛋白單體與聚合物結合后，熒光信號增強高達20倍。肌動蛋白聚合分為三個階段，就像微管組裝一樣，這三個階段分別是成核、生長和穩態。聚合的程度可由穩定狀態的熒光水平來表示，加入phalloidin（鬼筆環肽）可測量出上限，將CC降至0.01mg/mL以下。這種檢測方法的準確率超過95%，并且在檢測過程中不會干擾樣品。

圖2 通過芘肌動蛋白熒光測量肌動蛋白的聚合情況

2）DNase酶抑制法

DNase酶抑制法是基于G-actin與DNase 1之間高親和力的相互作用，從而抑制DNase的活性。這種檢測方法的大優勢在于它能區分G-actin和F-actin，因此，它通常被用于選擇性地測定細胞提取物中單體和絲狀肌動蛋白的量。此外，DNase酶抑制法還可以用于研究從肌動蛋白絲生成G-actin的結合蛋白。

3）粘度檢測法

根據需要檢測的聚合物差異性，粘度檢測法可以分為高剪切或低剪切測量。如果是想測量短(1µm)和中(3-5µm)肌動蛋白絲之間的微小差異，那么可以選擇高剪切法；如果要確定長絲樣本的差異，則需要使用低剪切法。雖然粘度檢測法能很好地比較兩個樣品之間的細絲交聯情況，但最大的缺點是需要儀器設備、剪切細絲不太準確，并且當在測量肌動蛋白組裝的方法時會干擾反應。

4）Spin-down實驗

Spin-down檢測法的原理是利用沉降差異來分離F-actin和G-actin，由于檢測時間有限，這種方法的主要用途是獲得穩定狀態下肌動蛋白聚合物的定量值。該方法可與芘結合熒光法或DNase酶抑制法聯合使用，以定量測定反應時間過程中肌動蛋白聚合物的數量。由于這種方法對待測樣品具有破壞性，因此只有在對樣品進行了所有其他測量方法后才能使用。這種檢測方法還存在另一個缺點，那就是小的肌動蛋白寡聚體不會沉淀，因此定量值可能會高于實際上清液中肌動蛋白單體的數量。

表1 肌動蛋白聚合物的檢測方法對比

2、肌動蛋白的染色

肌動蛋白另一個重要的研究方案，就是它在細胞或組織中的熒光成像，最常見熒光染料是鬼筆環肽偶聯物(phalloidins)。鬼筆環肽，又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)中分離到的一種七肽毒素，以ji高的親和力和特異性結合F-actin，不會結合G-actin。鬼筆環肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環肽分子的化學計量比結合。鬼筆環肽的非特異性結合幾乎可忽略，染色和未染色區域的差異極其明顯。此外，還有上文提到的，鬼筆環肽使得肌動蛋白聚合CC值降至1μg/mL，可用作一種聚合增強劑，產生的復合物高度穩定（解離常數約3×10^–8M），能夠抑制細胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

由于熒光標記的鬼筆環肽不具有細胞透性，因此多用于固定細胞的肌動蛋白染色。帶正電或負電的熒光染料會通過非特異性的離子相互作用與其他蛋白質結合，導致產生更高的背景；Actin-stain系列的鬼筆環肽熒光探針是非離子型的，因此更有助于獲得理想的低背景結果。

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