Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading

Keywords: Chondrocytes; Estrogen receptor-α; Mechanical loading; Mechanotransduction; Osteoarthritis; Senescence.

雖然骨關(guān)節(jié)炎（OA）的發(fā)病機(jī)制是多因素的，但關(guān)節(jié)表面的機(jī)械超負(fù)荷是 OA 發(fā)病和進(jìn)展的已知驅(qū)動(dòng)因素。軟骨細(xì)胞衰老被認(rèn)為是OA軟骨的一個(gè)重要特征。研究表明，人軟骨細(xì)胞在動(dòng)態(tài)壓縮負(fù)荷大于20% 時(shí)，可誘導(dǎo)衰老相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，然而，機(jī)械負(fù)荷影響軟骨細(xì)胞衰老的機(jī)制仍有待闡明。

研究報(bào)道，與健康對照組相比，OA患者軟骨細(xì)胞上的雌激素受體-α（ERα）水平降低。此外，在 OA 的體外模型中，用促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）刺激軟骨細(xì)胞上調(diào) microRNA 203（miR-203）表達(dá)，從而拮抗 ERα 功能，導(dǎo)致炎癥增加，細(xì)胞活性和軟骨生成基質(zhì)蛋白表達(dá)降低。這支持ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型中的作用。有趣的是，發(fā)現(xiàn)靜水壓力形式的機(jī)械負(fù)荷可以通過 ERα 調(diào)節(jié)成骨，這支持通過 ERα 探索軟骨形成表型的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。

鑒于此，美國匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院骨科及中國中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科的研究團(tuán)隊(duì)曾證明了 ERα 是 OA 中軟骨細(xì)胞表型的重要調(diào)節(jié)因子，包括調(diào)節(jié)衰老和降解酶的產(chǎn)生。特別是，ERα 缺失的軟骨細(xì)胞通過顯著提高與肥大和成骨相關(guān)的分子的表達(dá)水平來響應(yīng)損傷性的機(jī)械負(fù)荷，這是 OA 軟骨中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵特征。因此，恢復(fù)和維持軟骨細(xì)胞中的ERα功能可能代表了OA的未來治療干預(yù)。研究成果發(fā)表在 Osteoarthritis and Cartilage 期刊題為“Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading”。

首先，研究人員從接受 TKA（全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)）的患者中收集人類 OA 膝關(guān)節(jié)軟骨組織，所有保存的軟骨均有輕微至輕度的宏觀損傷，對照軟骨樣本表面完整，受損軟骨樣本表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化。

與對照軟骨相比，受損軟骨含有較少的糖胺聚糖（GAG），并顯示出更高水平的MMP13、p16^INK4a 和SA-β-gal。為了證實(shí)組織學(xué)結(jié)果，從保存的（P-CHs）和受損（D-CHs）軟骨中分離出軟骨細(xì)胞（CHs），進(jìn)行qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測，發(fā)現(xiàn)D-CHs在衰老、炎癥、纖維化、成骨和降解相關(guān)基因方面的表達(dá)水平高于P-CHs。蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了D-CHs的衰老和骨關(guān)節(jié)炎特征，如較高水平的p16^INK4a、p21 和 MMP13。通過檢測P-CHs和D-CHs的軟骨形成能力，發(fā)現(xiàn)D-CHs產(chǎn)生的軟骨顆粒通常遺傳了受損軟骨的表型，如低GAG沉積和高水平的細(xì)胞衰老（圖1 A）。

總的來說，與保存的對照軟骨和 P-CHs 衍生組織相比，受損的軟骨和 D-CHs 衍生組織表現(xiàn)出更高水平的衰老、炎癥、纖維化、成骨和降解。

由于p16^INK4a 在 D-CHs 中顯著上調(diào)，因此測試了抑制 p16^INK4a 是否可以逆轉(zhuǎn) D-CHs 中的 OA 表型（圖1 B）。結(jié)果表明，在2D軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上，sip16^INK4a 處理顯著降低 p16^INK4a 水平（圖1 F），并部分逆轉(zhuǎn)衰老水平（圖1 C、D）。但是，p16^INK4a  抑制的D-CH顆粒在軟骨生成刺激下無法產(chǎn)生軟骨（圖1 E），盡管軟骨生成基因水平?jīng)]有顯著受損（圖1 D）。此外，抑制p16^INK4a 促進(jìn)了 MMP13 的表達(dá)（圖1 D、F）。這說明，在 D-CHs 中抑制 p16^INK4a 不會(huì)增強(qiáng) D-CHs 在體外生成健康軟骨的能力。

圖1   通過siRNA抑制D-CHs中的p16INK4a在逆轉(zhuǎn)D-CHs的不良表型方面的益處有限。

接下來，為了確定對照和受損組軟骨之間的差異因子，進(jìn)行了RNA-Seq分析以檢查P-CHs和D-CHs的轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示，D-CHs中軟骨降解相關(guān)基因的變化最大。有趣的是，雌激素受體家族和雌激素受體-1（ESR1），一種編碼雌激素受體-α（ERα）的基因，都位列上游調(diào)控因子的前5名。與P-CHs相比，D-CHs的ESR1表達(dá)顯著降低。ERα的下游靶點(diǎn)顯示，許多與軟骨功能和OA相關(guān)的基因被預(yù)測受ERα調(diào)控，包括p16^INK4a 。通過檢測不同樣本中的ERα水平，驗(yàn)證了ERα在嚴(yán)重?fù)p傷的軟骨中下調(diào)。

由于 D-CHs表現(xiàn)出低 ERα 表達(dá)，因此測試了升高 ERα 是否可以逆轉(zhuǎn) D-CHs 的 OA 表型。結(jié)果表明，增強(qiáng) ERα 水平不僅降低了衰老水平且增加了增殖潛力，同時(shí)也改善了OA表型。這說明，ERα 可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型。

由于軟骨損傷最常見于體內(nèi)機(jī)械應(yīng)力最高的膝關(guān)節(jié)區(qū)域，因此實(shí)驗(yàn)還研究了降低的 ERα 水平是否與機(jī)械負(fù)荷有關(guān)，以及降低的 ERα 水平是否改變了軟骨細(xì)胞對機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中使用了0.2 Hz，0%、5%和20%的應(yīng)變，分別代表了靜態(tài)、中等負(fù)荷和損傷性負(fù)荷的情況。結(jié)果顯示，5% 或 20% 動(dòng)態(tài)壓縮負(fù)荷下，軟骨細(xì)胞ESR1的表達(dá)降低（圖2 B、C、F）。此外，20% 負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致 siCON 細(xì)胞中分解代謝基因（如 ADAMTS4 和 MMP13）的上調(diào)，以及衰老標(biāo)志物（包括p16^INK4a 和p53）的增加（圖2 B、D-F）。這說明，ERα水平受機(jī)械負(fù)荷的調(diào)節(jié)。

考慮到ERα對軟骨細(xì)胞衰老和軟骨形成表型的影響，以及其對機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)還研究了ERα在調(diào)節(jié)壓縮負(fù)荷對軟骨細(xì)胞表型的影響中的作用。結(jié)果顯示，當(dāng)存在ESR1 表達(dá)時(shí)，20% 應(yīng)變下的機(jī)械負(fù)荷不再引起先前看到的p16^INK4a 和 MMP13 表達(dá)的增加。相反，敲低ESR1 表達(dá)時(shí)施加機(jī)械負(fù)荷會(huì)降低這兩種分子的表達(dá)（圖2 B、D-F）。值得注意的是，機(jī)械負(fù)荷和 ESR1 敲低都增加了 P-CHs 中磷酸化的p65（pho-p65）的水平，這是細(xì)胞應(yīng)激的代表性標(biāo)志物。這些數(shù)據(jù)說明，抑制 ERα 會(huì)改變軟骨細(xì)胞對壓縮負(fù)荷的反應(yīng)性。

圖2    ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞對機(jī)械負(fù)荷反應(yīng)中的作用—檢測分解代謝和衰老相關(guān)標(biāo)志物。

最后，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了機(jī)械負(fù)荷和ERα表達(dá)在調(diào)節(jié)軟骨生成、纖維化和成骨基因中的相互作用。當(dāng)ESR1表達(dá)保留（siCON）時(shí)，5% 和20% 應(yīng)變下的機(jī)械負(fù)荷對成骨或纖維化標(biāo)記基因的表達(dá)沒有顯著影響，盡管OSX和VCAN在20%壓縮應(yīng)變下顯著上調(diào)（圖3 A）。然而，COL2A1 存在應(yīng)變反應(yīng)性的下調(diào)（圖3 D）。有趣的是，單獨(dú)敲除 ESR1 （0% siESR1）顯著上調(diào)了 OCN 的表達(dá)，同時(shí)抑制了 COL2A1 和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白 （COMP） 的水平（圖3 A-D）。雖然 5% 的應(yīng)變壓縮負(fù)荷對 ESR1 敲除沒有緩解作用，但 20% 的應(yīng)變傾向于進(jìn)一步上調(diào)肥大相關(guān)標(biāo)志物，包括 COL10 和 OCN（圖3 B-D），同時(shí)還逆轉(zhuǎn)了 ESR1 敲除對 COL2A1 和 COMP 水平的抑制作用（圖3 D）。值得注意的是，與P-CHs相比，在人類的D-CHs中也觀察到OCN水平的提高（圖3 E、F），并且與野生型對照相比，在從ESR1 敲除小鼠中分離的軟骨中也觀察到OCN水平增強(qiáng)（圖3 E、G）。這說明，ERα 的缺失和壓縮超負(fù)荷協(xié)同增加軟骨細(xì)胞的肥大轉(zhuǎn)化。

應(yīng)該注意的是，瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族v 成員4（TRPV4）的表達(dá)是一種gongren的機(jī)械敏感 Ca2+ 通道，對機(jī)械負(fù)荷也有反應(yīng)。在siCON組中，5% 的負(fù)荷顯著上調(diào)了TRPV4的表達(dá)，然而，較高的壓縮應(yīng)變（20%）適度降低了TRPV4的表達(dá)（圖3 D）。此外，ESR1敲除不會(huì)改變TRPV4蛋白水平，但確實(shí)調(diào)節(jié)了機(jī)械負(fù)荷的影響，因?yàn)樵黾討?yīng)變幅度會(huì)誘導(dǎo)TRPV4表達(dá)可觀察到的劑量依賴性增加（圖3 D）。

基于上述研究的結(jié)果，ERα在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型和對機(jī)械超負(fù)荷反應(yīng)中的途徑如圖4所示。

圖3    ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞對壓縮負(fù)荷反應(yīng)中的作用—檢測軟骨形成、肥大、纖維化和成骨相關(guān)標(biāo)志物。

圖4    ERα信號通路在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞表型中的作用。機(jī)械負(fù)荷降低健康軟骨細(xì)胞的ERα水平，這與軟骨細(xì)胞的衰老和OA轉(zhuǎn)化有關(guān)。在ERα水平降低或缺失的情況下，其他機(jī)械傳感器將機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為生化刺激，促進(jìn)軟骨形成、肥大和成骨。

總之，該研究表明，ERα在介導(dǎo)軟骨細(xì)胞表型及其對機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)中具有新的雌激素非依賴性作用，并表明提高ERα水平可能代表了一種治療骨關(guān)節(jié)炎的新方法。

參考文獻(xiàn)：Wang N, Zhang X, Rothrauff BB, Fritch MR, Chang A, He Y, Yeung M, Liu S, Lipa KE, Lei G, Alexander PG, Lin H. Novel role of estrogen receptor-α on regulating chondrocyte phenotype and response to mechanical loading. Osteoarthritis Cartilage. 2022 Feb;30(2):302-314. doi: 10.1016/j.joca.2021.11.002. Epub 2021 Nov 9. PMID: 34767957.

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